四、分子点睛（变量一、分子）
分子点睛学员笔记03.png
恒量为PART1中的疾、型、模、法、标
在这中间套变量，分子，有两个问题重点讨论
1、怎么证明一个分子有某个方面功能表型？
唯一的干预因素（加，Gain of function，或者over-expression/反之，Loss of function）
所以证明一个分子有某个方面的功能表型 的方法，就是操作分子，人为的改变这个分子的表达，让这个分子表达上升，观察到表型， 然后再把这个分子表达降低，观察到表型消失了，这就证明了表型的存在与分子的上下表达 有明显的相关性，由此可以下结论。
+设立对照组
过表达方法：质粒或者病毒
质粒：环状DNA分子，作为专门表达基因的分子设备，自带一套完整元件，因为细胞膜是磷脂双分子层，质粒DNA自己无法穿进去，所以需要特定试剂等方法，称为转染transfection（常用的有脂质体，与细胞膜有亲和性，与细胞膜可融合；还有电穿孔法与磷酸钙转染，简称钙转），什么细胞用什么转染方式效果，需要摸索实验。
转染质粒这个经典操作，就用 Transfection，而质粒在大肠杆菌里做转化，叫 Transformation
如果很难转，就改用病毒（如神经细胞，干细胞，原代细胞等）
有些病毒还有细胞的亲噬性，可以靶向一些细胞，特异性的感染。感染叫 infection， 也可以用转导，transduction
反正目的都是为了某个基因的过表达，观察表型的变化从而确认它有无预期功能。
抑制：RNA干扰技术（抑制更常用）
因为医学研究里，我们关注的分子往往是疾病的致病因素，是伴随疾病 的发生表达增高的，我用 Loss of function 人为的抑制它的表达，这样可以观察是否疾病相关 的表型会减轻，起到治疗的模拟作用。
常规来说，疾病中高表达的基因，我们可以采用下调 手段来研究，而疾病中低表达的基因，也就是一些预防性的分子，我们可以采用上调手段研 究，这样更合乎逻辑。生物系统非常复杂，但一个分子在疾病中只有高了或者低了一种稳定 状态，很少会遇到动态变化的案例。即使是高或者低一种状态，也可以一正一反来回验证。 前面讲模型的时候提到细胞株，一个疾病可能有多株细胞株，那么围绕一个分子你也能找到 相对高表达的和相对低表达的细胞，在高表达的里面抑制分子，在低表达的里面过表达分子 就能实现正反双向研究，这种套路很严谨也很常见。
RNAi 技术的革命性意义就在于它太便利了，只要合成一段 21 个 碱基的 siRNA，转染到细胞里就能对目标基因实现 70%以上的表达沉默。RNAi 的运作机制是细胞自带的 ，当 si RNA 进入细 胞的时候 ，会被一个叫RISC( RNA induced sliencing complex) 复合体的蛋白结合，然后以序列互补的形式找 siRNA匹配的mRNA靶点，一旦配上就启动核酸内切酶活性把特定基因的mRNA降解掉，从而高效、特异地阻断体内特定基因表达。 siRNA的设计有一些原则，但并不是特别难，一个基因可供选择的 siRNA序列很多，比如sigma 网站上就有人基因预设计的 siRNA 序列，一般来说设计三条 siRNA 总有一条是有效的。这也是为什么做 RNAi 实验时候一般多做几条序列的原因，要先筛一筛有效序列然后进行功能验证。用 RNAi 沉默基因有个术语叫 Knockdown，翻译过来叫敲降或者叫敲减，这是跟基因敲除的 Knockout 是相对应的。
还有一些其他的基因编辑方法可以实现基因的 Knockout，在 DNA 水平把基因的编码序列 DNA 破坏掉。比如锌指酶 ZFN 和另一种核酸酶 TALEN，现在被CRISPR基本取代，因为CRISPR 改良之后几乎跟 RNAi 一样方便。你就设计一段 sgRNA，跟 siRNA 差不多，然后导入一个 Cas9 核酸酶蛋白，差不多就搞定了。它比 RNAi 就多了一个Cas9 蛋白共转，过表达 Cas9 的模型细胞其实可以做好了备在那里用，所以真的很方便。
2、分子有很多具体的类型
基因DNA，在肿瘤中不稳定，突变缺失
除了DNA本身序列变化外，表观遗传学的改变，可以造成基因表达水平的变化，mRNA和蛋白质发生变化
现阶段的爆款，RNA，而且是非编码RNA
在 2001 年，Science 杂志的一篇文章中第一次出 现 microRNA 的概念，micro 就是微小的意思，因为这种 RNA 分子很短，长度只有 20 个碱 基左右，所以叫 microRNA。概念的确认是 2001 年，但最早的一条 miRNA 要追溯到 1993 年，在模式生物线虫中被发现的。当时哈佛大学的研究者在一项研究中发现，有一个控制线虫发育的基因 lin-4 并不编码蛋白质，而是合成两个小的 RNA 分子。其中一个长度约 22nt， 另一个约 61nt。较长的小 RNA 具有茎环结构，被认为是较短那个的前体。进一步研究证实 lin-4 RNA 与 lin-14 基因 mRNA 的 3’非翻译区形成多个位点的互补结合，从而对基因表达进行调控，能够显著减少 Lin-14 蛋白的合成，但并不减少它 mRNA 的表达量。那个时候，科学家们还认为这是个案。在 lin-4 发现后的 7 年中，在各种生物中都没有发现与 lin-4 相似 的 RNA。直到 let-7 这个 miRNA 的出现改变了这种认识，同样是 22 碱基长度，同样控制线 虫发育时相，let-7 与lin-4 采取相同的作用方式，控制线虫由晚期幼虫向成虫的转化。Lin-4 是线虫由幼虫第一阶段向第二阶段转化的调控环节，由于这两个 miRNA 在控制线虫发育时相方面有相似的功能，科学家们就觉得不是偶然了。
在 2001 年，Science 就同一期报道了 3 个研究小组，在线虫、果蝇和人 cDNA 文库中鉴定出的近百个与 lin-4 和 let-7 相似的的小分子 RNA，并统一命名为 microRNA (miRNA，微 RNA)。miRNA 的发现可 以算是非编码 RNA 研究的里程碑，它揭示了细胞中存在一个由内源非编码 RNA 介导的， 转录后基因调控的普遍机制。这之后科学家在大量生物体中发现了数以千计的 microRNA。 它们都是大约 22nt 长度的内源性 RNA 分子，由茎环结构的前体加工而成，而且在进化过程 中一般比较保守。MicroRNA 的作用是可以负向调节一个基因的表达，几个 miRNA 可以共同调节同一个基因。一个 miRNA 也可以同时调节几个基因，形成一个复杂的调控网络。据 推测，miRNA 至少调节着人类三分之一的基因。
区别：siRNA 是一个研究工具，做基因沉默的时候用来抑制一个表达基因的，而 microRNA 是研究对象，是你研究的靶分子一 种类型，miRNA 并不能人为设计好用于做沉默实验，这就是他们之间不同。作为研究对象， miRNA 是内源的，而 siRNA 大部分是外源导入的，虽然内源性的也有，但大家基本碰不到， 属于很小众的研究方向
长链非编码RNA，Long non-coding RNA, 简称 lncRNA。
lncRNA 是长度大于 200 个碱基的非编码 RNA，不编码蛋白，是一种调控性分子。lncRNA 的发现其实比 miRNA 还早，最早是1990年在哺乳动物的细胞中鉴定了第一个 lncRNA——H19。刚发现的时候也没意识到它是普遍存在的调控分子。最近十年，是因为受到小 RNA 研究的启发以及新的测序技术推动，lncRNA 被大量鉴定出来，又发现它具有异常丰富的结构和功能的多样性，这就引起了研究者们极大的关注。miRNA作用方式比较简单，lncRNA就复杂得多了，基本上蛋白能够执行的调控形式，lncRNA 都能参与。比如它可以像转录因子一样，与编码基因上游的启动子区结合，干扰基因表达。它也可以通过与基因之间竞争转录因子的方式导致基因表达的沉默。它可以发挥像脚手架一样的结构作用将两个蛋白连接在一起发挥功能。它也可以与蛋白编码基因的转录本形成互补双链，干扰 mRNA 的剪切，产生不同的剪切形式。还可以通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的活性或胞质定位。LncRNA和 miRNA 也可以结合，作为 miRNA 的靶分子。它还可以作为小分子 RNA，如miRNA，piRNA的前体分子。lncRNA 涉及了基因表达调控的方方面面，所以研究的灵活性很大
miRNA 是非编码必学的入门分子类型， 而 lncRNA 是进阶的不二选择。
还有新的热点，2012年有研究证实在人细胞的基因表达程序中，环状RNA 分子(Circular RNAs，circRNA)是一种比线性RNA分子更普遍的特征。与传统的线性RNA不同，circRNA 分子呈封闭环状结构，不受 RNA 外切酶影响，表达更稳定不易降解。本质上，circRNA 属于 lncRNA 的一个分类，不是一种新的分子类型，正因为它的研究特征跟 lncRNA 一致，所以现有报道 circRNA 也比较全能，参与各种调控过程。在功能上，最主要 的一种作用形式是发现，circRNA 分子经常富含 miRNA 的结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，通过竞争性的结合 miRNA，就解除了 miRNA 原本对它靶基因的抑制作用，导致靶基因的表达水平上调。这种作用机制还有一个专业的名称，叫竞争性内源 RNA(ceRNA)。ceRNA 不是一种分子类型，而是描述了一种分子调控的机制模式。
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