深入理解结直肠癌（CRC）发生和进展的生物学机制，对于开发用于早期诊断的临床相关生物标志物，早期针对性治疗疾病是必不可少的。莱顿大学医学中心的科学家团队于2022年11月在《Gut》（IF=31.793）杂志上发表题为“Transcriptomic and immunophenotypic profiling reveals molecular and immunological hallmarks of colorectal cancer tumourigenesis ”的研究性论文。该研究利用最新的DSP（Digital Spatial Profiler）数字化空间多组学分析技术获得了正常结肠组织的空间表达谱数据，结合癌变结肠组织的空间转录组数据，逐步剖析了CRC恶性转化过程中转录组和免疫水平所发生的变化，并从中发掘出临床相关的生物标志物 — CD47/SIRPα。
01研究背景
结直肠癌是由于上皮细胞中基因突变的逐渐积累，最终导致不受控制的增殖和恶性转化。目前对于CRC发病和进展机制背后的生物学过程的理解仍然不足以对该疾病进行最佳管理。迄今为止，理解肿瘤微环境中不同细胞在恶性转化中所发挥的作用相关的研究仍然较少。目前现有的分析方法是通过bulk组织和单细胞测序进行分析，然而他们所共有的缺陷是缺乏跨不同区域的空间背景和细胞组成的信息。DSP数字化空间多组学技术可以在保留组织形态学背景的同时获取不同组织位置或区域的基因表达谱，进一步帮助深入剖析与恶性转化有关的生物学过程。
02研究目的
03研究方法
（1）早期结直肠癌(如pT1结直肠癌)特别适合用空间方法进行分析，因为同一病变内存在不同的组织，包括正常粘膜组织、不同程度发育异常组织以及肿瘤组织，从而代表恶性转化的早期过程，这是阐明支持CRC肿瘤发生的生物学过程的独特模型。
（2）研究人员利用DSP空间多组学平台对8个pT1 CRC样本进行了检测探究，每个样本都选择了9个感兴趣区域，并获取了不同组织学区域中上皮和基质细胞的基因表达谱，包括正常粘膜组织、较低程度发育异常组织、高度发育异常组织以及肿瘤组织。
（3）联合成像质谱流式对连续的组织切片进行分析以揭示免疫学背景。另外，研究人员还利用公开的单细胞RNA-Seq数据，结合空间转录组数据进行综合分析，确定了相关转录本的细胞来源。
04研究思路
图1 早期CRC的DSP数字空间分析（A）基于pT1 CRC样本的H&E染色，圈选具有不同组织学特征的区域（B）与图(A)所示相同样本上进行PanCK和Vimentin的免疫荧光检测。在每个ROI上再进行segment分割圈选，用Vimentin+(粉红色)和PanCK+(橙色)可视化。插图:单个ROI的放大
为了剖析CRC发生和发展过程中的分子变化，该研究中首先将pT1 CRC样本进行H&E染色(图1 A)，基于该染色样本利用DSP空间多组学平台在相同样本上进行PanCK和Vimentin染色并圈选9个不同组织学的ROI感兴趣区域(图1 B)。分析上皮和基质细胞的瘤内转录变化，分别查看了每个ROI/AOI内的PanCK 和 Vimentin 阳性表达部分。
图2 早期CRC的DSP数字空间分析及发生进展中差异基因表达在上皮和基质的IHC染色情况
根据tSNE的总体基因表达概况，对所有AOI进行降维分析，差异表达基因的火山图分析、无监督聚类的基因表达热图分析等，最终找到了在上皮区和基质区特异性表达的基因，并通过IHC对这些基因进行了验证(图2)。这些与肿瘤相关的蛋白质可以作为CRC早期发现和适当分期的有希望的候选生物标志物。
图3 WikiPathways通路富集分析
因为对CRC进展过程中的免疫相关改变感兴趣，作者还研究了不同组织学区域之间肿瘤(免疫)微环境的改变。通过通路分析发现了在恶性转化早期的炎症反应，CRC发作伴随着先天免疫反应和核酸感应通路的激活(图3)，相关基因表达上调。
图4 巨噬细胞亚群在正常结直肠组织逐步向癌症发展过程中的相应转移及CD47/SIRPα的上调
为了更好地证实CRC肿瘤发生过程中免疫微环境的改变，作者对来自相同病变的连续切片进行了成像质谱流式，研究发现，从正常结肠组织到发育异常再到转变为肿瘤的过程中，髓系细胞浸润增加；并且巨噬细胞发生从促炎症的HLA-DR+ CD204+巨噬细胞亚群到HLA-DR-CD204+免疫抑制亚群的转变。同时利用IHC检测发现，转变过程中伴有CD47/SIRPα 信号的上调。
05研究结果
通过比较pT1 CRC样本中不同组织空间区域的基因表达谱，研究人员鉴定出不同组织区域中的上皮细胞和基质细胞中的差异表达基因。
在CRC恶性转化的早期阶段，MUC4、SPINK5在上皮细胞中特异性地表达下调， CD81、CD46上调；NOTCH3、PDGFRB、Thy1和Hsp47在基质细胞表达上调。这些与肿瘤相关的蛋白质可以作为CRC早期发现和适当分期的有希望的候选生物标志物。
通路分析发现了在恶性转化早期的炎症反应，CRC发作伴随着先天免疫反应和核酸感应通路的激活，相关基因表达上调。
研究人员还发现，从正常结肠组织到发育异常再到转变为肿瘤的过程中，髓系细胞浸润增加；巨噬细胞发生从促炎症的HLA-DR+ CD204+巨噬细胞亚群到HLA-DR-CD204+免疫抑制亚群的转变，同时伴有CD47/SIRPα 信号的上调。
06小结
该项研究利用最新的DSP空间组学分析技术从空间生物学角度深度剖析了伴随着CRC恶性转化的转录组和免疫学变化，阐明了CRC发病和进展的生物学过程；进一步确定了与疾病进展密切相关的生物标志物；以及未来可应用于临床免疫治疗的潜力靶标 — CD47-SIRPα。
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