本文译自Targeted Inhibitionof CD47-SIRPα Requires Fc-FcγR Interactions to Maximize Activity in T-cell Lymphomas.
要点：
与不同T细胞淋巴瘤亚型之间MHCI表达几乎一致相反，这些亚型表面CD47蛋白表达水平差异很大。
靶向CD47抗肿瘤功效的最大化依赖于Fc – FcγR的相互作用
摘要
靶向CD47的抗体通过与结合肿瘤细胞CD47的结合阻碍其与吞噬细胞SIRPα的相互作用，对于多种癌症类型包括T细胞淋巴瘤(TCL)十分有效。本文中，我们证明了初级TCLs表面CD47的表达是不均一的，而同样可以抑制吞噬作用的MHC I表达是类似的。多个单克隆抗体(mAB)阻碍CD47-SIRPα相互作用从而提升TCL细胞的吞噬作用，与靶向MHC I抗体联用可以促进这一效果。表面CD47的表达以及调节CD47 pyroGlu化的基因与TCL中CD47阻断引起的吞噬作用没有相关性。多例人TCL患者来源的异种移植肿瘤(PDXs)或免疫小鼠TCL模型中，短疗程抗CD47单抗的体内治疗可显著降低淋巴瘤负担并延长生存期。巨噬细胞的清除会降低这种体内疗效，而中性粒细胞的清除则无影响。只有F (ab) 2段的CD47抗体不能诱导由人类巨噬细胞的吞噬作用，这表明这一过程依赖于Fc-FcγR相互作用。相比之下，独立于SLAMF7-Mac-1相互作用，F(ab‘)2片段能够增加小鼠巨噬细胞的吞噬作用。CD47全长抗体也可以诱导FcγR缺陷小鼠巨噬细胞的吞噬作用。IgG1抗CD47抗体诱导了TCL细胞吞噬作用，与mogamulizumab（抗CCR4单抗）或者抗MHC单抗联用，可以增强NK细胞介导的细胞毒性作用。这些研究有助于解释对小鼠模型以及病人阻断CD47单一治疗的独立作用，对单独或联合使用抗CD47单克隆抗体也有直接的借鉴意义。
前言
肿瘤细胞上高表达的CD47可以与信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用从而抑制巨噬细胞和树突cells的吞噬作用。一些疗法，包括阻断配体的CD47或SIRPα单克隆抗体(mab)，改造的受体，破坏CD47-SIRPα轴的双特异性药物，都被证明对各种不同谱系的肿瘤临床模型有抑制活性。
目前临床试验中的药物可根据其同型主干、CD47结合成分和Fc结构域进行分类。Hu5F9-G4、SRF231和CC-90002都是具有功能Fc域的IgG4单克隆抗体。Hu5F9-G4对58例晚期癌症患者I期临床阶段研究的初步结果显示了耐受性，但没有临床效果。相比之下，Hu6F9-G4联合抗CD20人IgG1抗体利妥昔单抗，在利妥昔单抗难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤患者中完全缓解率为36%。
TTI-621是一种可溶性重组融合蛋白，含有人SIRPα的CD47-binding域，可以与人IgG1的Fc域结合。对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)患者I期临床研究的初步结果显示，只需一次瘤内注射，循环淋巴瘤的负担和皮肤病变的严重程度均可迅速减轻。
ALX148是另一种融合蛋白，包含一个改造的高亲和性的 SIRPα的CD47结合域，可以与人Fc结合但不能结合Fcγ(FcγRs) 。在I期临床研究中，24例接受单药ALX148治疗的可评估患者中有1例，前5例接受ALX148联用另一种抗体治疗的可评估患者中有3例病情稳定，疗效最佳。
总之，这些数据表明，要使封闭CD47发挥最大功用可能需要功能性的特别是IgG1亚型的Fc区域。这些数据也与在小鼠模型中的研究形成了对比，后者显示，那些单一治疗时在体内对缺乏活性的药物联合使用时疗效显著。最近认为，包括beta-2微球蛋白/MHC I类、SLAMF7和影响CD47pyroglutamation的因子在内的多个分子，是影响吞噬反应的调节因子，可能影响CD47封闭疗效。
我们试图使用原发样本和T细胞淋巴瘤(TCL)体内模型解释人SIRPα和FcγRs在封闭CD47活性中的调节作用。这些病人急需新的疗法。在此，我们描述了多个TCL亚群诱导CD47阻断后巨噬细胞和NK细胞应答相关因子的分子流行病学和机制。
方法（略）
结果（节略）
CD47在人TCLs表面广泛表达，但表达不均一。以前的研究报道，在急性髓系白血病或B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的生物特异性蛋白中，CD47 mRNA的高表达会导致预后不良。对mRNA表达的研究可能存在很大的问题，因为它们可能无法区分恶性细胞和/或反映表面蛋白的表达。因此，我们通过流式细胞术检测了来自健康献血者外周血(血液)的多个TCL和B细胞淋巴瘤(BCL)系和CD3+ T细胞表面的CD47蛋白表达。静息状态的CD3+ T细胞(通常较小)和转化后的T细胞(通常较大)之间的大小差异可能通过流式细胞术进行区分，因为较大的细胞可能具有更大的总表面积。因此，标准化细胞大小将提供一个更准确的CD47表面密度标记。与健康的CD3+ T淋巴细胞相比，来自多个亚型的TCL表面CD47密度是相当或更高的。CD47在许多TCL亚型上的表面密度与Burkitt、弥漫大B细胞(DLBCL)和套细胞淋巴瘤系相当。免疫印迹法检测总细胞CD47也得到类似结果。以流式细胞术为基础的每个细胞CD47分子的定量分析显示，B和T细胞淋巴瘤细胞系的结果与表面表达结果一致。通过RNA测序我们发现，在非恶性T细胞、TCL和TCL PDXs CD47的转录存在差异。
为了评估淋巴瘤细胞CD47蛋白在原代样本中的表达情况，我们采用免疫组化(IHC)染色技术对68例患者组织芯片(TMA)进行了评估。根据Jurkat野生型(WT)和CD47-敲除细胞的染色结果，人抗CD47克隆279对人CD47蛋白具有明显的特异性，并被选择用于TMA染色。我们生成了一个H评分(定义为CD47阳性×CD47染色强度(0-3)的淋巴瘤细胞的百分比)。
我们根据CD47的H评分和阳性细胞百分比将患者分为四组，并比较从活检后治疗开始的无进展生存期(PFS)。CD47 H评分四分位数间PFS无显著性差异或基于CD47阳性淋巴瘤细胞百分比的四分位数。我们采用了递归分割方法，但无法根据CD47 H评分或CD47阳性淋巴瘤细胞的百分比来确定最佳分割，以使各组间PFS存在显著差异。在CD47阳性淋巴瘤细胞百分比(按中位数以上或低于中位数分为两组)与其他预后变量如国际预后评分(IPI)或疾病分期(表S1)之间也未发现明显的相关性。
抗CD47抗体在病人来源的异种移植(PDX)体和TCL免疫增强模型中高度活跃。
我们将表达ITK-SYK的淋巴瘤细胞移植到同基因的C57BL/6 小鼠中，以确定CD47阻断是否对免疫能力强的动物也有效。移植后，用抗小鼠CD47 IgG1单抗MIAP410或同型对照(MOPC-21)处理。与同型对照相比，MIAP410也提高了存活率。
抗CD47单克隆抗体诱导巨噬细胞选择性吞噬TCL。我们试图阐明CD47阻滞诱导上述体内效应的机制。首先，我们从移植入TCL的小鼠体内去除肿瘤浸润性巨噬细胞和中性粒细胞。HSTCL PDX移植NSG小鼠中Ly6G+中性粒细胞的耗竭对SRF231的疗效无影响。与此相反，联合给予氯膦酸钠消耗巨噬细胞显著降低了SRF231的活性，这与巨噬细胞是PDX模型中抗CD47抗体治疗的主要效应因子一致。为了确定可能在体内促进SRF231活性的因素，在使用SRF231或hIgG4治疗的第11天，从移植了HSTCL和NKTCL PDXs的小鼠中收集骨髓裂解液，并对65种人细胞因子进行多重分析。在所有被检测的细胞因子中，在两种肿瘤模型中，SRF231治疗后唯一显著增加的人类细胞因子是IL-18，这是一种促炎性细胞因子，可以刺激巨噬细胞的恢复。
为了直接证实SRF231通过BMDMs诱导TCL
PDX细胞吞噬，我们从小鼠中分离出了TCL细胞。我们证实这些细胞表面表达hCD47，用CFSE标记并与mBMDMs体外共培养。与hIgG4同型对照相比，SRF231增加了所有4个PDX的吞噬作用。因此，以CD47为靶点的小鼠单克隆抗体诱导吞噬细胞似乎具有很大的同型性和物种独立性。
抗CD47单克隆抗体诱导TCL产生ADCC。已有研究表明，CD47的参与可能诱导ADCP以外的细胞杀伤机制。用B6H12或B6H12-
higg1孵育TCL细胞对细胞凋亡的影响最小。同样，无论是小鼠补体还是人补体，当暴露于B6H12或B6H12-
hIgG1时，均未诱导产生补体依赖的细胞毒性(CDC)。
为了评估ADCC，我们采取了两种不同的方法。首先，我们使用了表达小鼠FcγRIII（小鼠NK细胞参与ADCC的主要FcR）的Jurkat细胞。通过添加B6H12或阳性对照抗体OKT3，这些Jurkat细胞产生的所有TCL系的ADCC均有所增加。为了检测B6H12介导的ADCC是否依赖于Fc，我们合成了一个B6H12的F(ab’)2片段。F (ab) 2片段没有增加ADCC，这表明B6H12引起的ADCC增加是通过Fc-FcγR相互作用介导的。
在第二个实验中，我们用人NK细胞直接检测TCL细胞的ADCC。无论是F(ab’)2片段还是小鼠B6H12都不能诱导人NK细胞ADCC。然而，B6H12-hIgG1能有效诱导TCL细胞和BCL细胞系Raji的ADCC。这些发现证实了Fc-FcγR相互作用对结合CD47的单抗所促进ADCC的重要性。
基于对Fc相互作用的依赖，在不同物种间CD47阻断诱导的ADCP存在差异。接下来，我们研究了以CD47为靶点的单克隆抗体诱导的ADCP是否需要与Fc的相互作用。使用mBMDMs，与同型对照相比，B6H12的F(ab’)2片段增加了TCL系的吞噬作用，但未达到与全长B6H12相当的水平。引人注目的是，与同型对照相比，B6H12的F(ab’)2片段能诱导TCL系产生少量或无吞噬作用。与预期一样，全长B6H12或F(ab’)2片段均未能通过mBMDMs或hMDMs促进CD47敲除的MAC2A细胞的吞噬作用。
CD47阻断诱导的TCL吞噬不需要SLAMF7-MAC1相互作用。最近的一项研究报道，CD47阻断诱导的人B淋巴细胞、小鼠B淋巴细胞和小鼠髓样肿瘤细胞的吞噬作用，在体外和体内都需要SLAMF7的同型表达。SLAMF7通过巨噬细胞上的蛋白质如DAP12和FcγRs含有的ITAM，通过Syk，BTK以及SRC等激酶介导免疫细胞的激活以及对肿瘤细胞的吞噬作用。SLAMF7可与整合素Mac-1相互作用，触发ITAM基序的磷酸化。因此，我们研究CD47介导的TCL细胞吞噬是否依赖于SLAMF7-Mac-1的相互作用。虽然CD3+ T细胞表达表面SLAMF7，但与同型对照相比，5个TCL细胞系中有5个缺乏任何可识别的SLAMF7表面表达。
讨论
我们的研究结果表明，CD47-blocking疗法效用的最大化依赖于FcγRs介导的效应细胞如巨噬细胞或NK细胞的招募。我们的观察还表明，CD47阻断后先天免疫应答的性质取决于阻断抗体的同型主干。hIgG1抗CD47mab可同时诱导肿瘤细胞的ADCP和ADCC，这可能部分解释了单药TTI-621对CTCL患者的临床疗效。
先前的研究已有报道称Fc-FcγR自发的相互作用对CD47-SIRPα轴有直接的影响。然而，这是基于对人类CD47和小鼠SIRPα的研究。我们的数据显示，在人类巨噬细胞，封锁CD47-SIRPα相互作用诱导的吞噬作用本身对一些细胞系而言，是比阴性对照更有效的次优策略。我们的研究比较了抗CD47抗体全长和F(ab’)2部分(无论是否有MHC
I类或抗CCR4抗体)，证实Fc部分对于最大限度地诱导效应反应至关重要。
我们还观察到，使用多个抗体药物F (ab) 2部分破坏CD47-SIRPα轴与在CD47缺失细胞的吞噬脆弱的显著区别。与野生型(WT)相比，MAC2A和K-299 CD47缺失细胞对巨噬细胞吞噬均表现出明显的敏感性。然而，当WT细胞被配体阻断浓度的抗CD47 F(ab’)2部分处理时，吞噬作用的增加很少甚至没有。这可能表明，CD47具有与SIRPα抑制吞噬作用截然不同的其他作用。另外,药物封锁可能无法100%阻止SIRPα的结合。第三种可能性是，通过敲除CD47而产生的内稳态(目前尚未确定)效应在某种程度上促进了吞噬倾向。
已有研究报道，在体内/外抗CD47治疗会诱导细胞因子，包括小鼠单核细胞趋化蛋白3 (MCP-3)的分泌。我们在分离的体内模型中鉴定出抗CD47单克隆抗体处理后TCL细胞对人IL-18的诱导作用。IL-18是一种促炎细胞因子，可通过PI3K/AKT和MEK/ERK1/2通路诱导巨噬细胞产生单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)/CCL2，从而促进活化。因此，可以想象，在CD47拮抗剂存在的情况下，肿瘤细胞分泌IL-18，从而增加MCP-1等细胞因子的产生，促进巨噬细胞的趋化迁移和活化。多项证据表明，IL-18在NK细胞分化和抗肿瘤功能中发挥重要作用。
虽然抗CD47治疗似乎能在小鼠TCL模型中诱导显著的抗肿瘤反应，但也有一些TCL系，如PTCL-NOS系SMZ1(与来自健康供体的CD3+ T细胞一样)，表现出对抗CD47单克隆抗体诱导的吞噬作用的固有抗性。评估其他抗吞噬调节因子，如MHC I类表面表达或影响CD47细胞pyroglutamation的因素，未发现这种耐药性的明显原因。因此，需要进一步的研究来确定能够应用于TCL等疾病患者的耐吞噬机制和生物标志物。
缺乏B、T和NK细胞的NSG小鼠中的PDX模型，有一个局限性是它们不能反应CD47拮抗剂在人体内反应的许多方面。NODSIRPα与人CD47的亲和力是人SIRPα-人CD47亲和力的十倍。这可能会混淆CD47阻断剂在不同小鼠模型中诱导吞噬作用的程度。在表达ITK-SYK的TCL细胞移植的野生型小鼠中，CD47阻断也有效。然而，观察到的小鼠巨噬细胞和人巨噬细胞之间的差异也造成了不小的困惑。因此，未来在人源化小鼠身上进行的研究可能有助于解答NK细胞的作用以及CD47单克隆抗体在体内的适应性免疫反应。特别是，CD47阻断对树突状细胞吞噬和T细胞启动的影响仍然知之甚少。
我们新增的关于封闭CD47-SIRPα相互作用的数据还不足以优化对肿瘤细胞吞噬的刺激作用。这些数据也与临床试验结果一致，表明抗CD47疗法与其他单克隆抗体联合使用时，疗效得到了改善。我们在这些研究中使用的临床制剂SRF231，目前正在对晚期恶性肿瘤的I期临床试验进行研究(NCT03512340)。我们的数据表明，需要通过ADCC和ADCP与IgG1单克隆抗体联合使用才能使疗效最大化。
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