在植物单细胞研究中，原生质体是首选材料，但在原生质体的制备中通常会存在植物细胞壁难分解和碎片率高等问题。目前原生质体的制备主要用到的方法为酶解法，在此过程中，样本的选择和处理、酶的选择、酶解条件和时间等都非常关键。现根据已有的参考文献和大量的实验经验积累，研发出了完备的原生质体解离方案。接下来以拟南芥的叶片为例，一起了解原生质体的制备过程、技巧和注意事项。
一、植株组织的获取
切取植株目标部位的幼嫩组织，去掉蔫萎/坏死组织和叶脉，将叶片切成0.5-1 mm的细条，置于培养皿中。关于样本的选择和处理上有以下技巧：
1. 植物组织一定要新鲜且幼嫩，非幼嫩组织纤维素化严重，解离困难。
2. 样本量要尽可能多，保证足够摸索和优化实验条件。
3. 组织细条的宽度尽可能小，增大酶与切口的接触面积有利于细胞壁的降解，同时方便原生质体游离出来。
4. 对于不易浸入酶解液的组织，可用真空泵辅助。
图1 拟南芥叶片组织获取与酶解
表1 常规组织类型推荐取材时间及总量
二、释放原生质体
加入酶液（一般需要包含纤维素酶和果胶酶），置于28℃环境中酶解几十分钟到数小时，以降解细胞壁，使原生质体释放出来。在酶种类的选择和酶解时间上有以下技巧：
1. 酶的选择可参照文献中相同/近缘种和成分相似的组织（注意材料幼嫩程度）。
2. 叶片类组织添加半纤维素酶，根系组织可添加离析酶可以提高降解细胞壁的效率。
3. 酶解过程中注意避光，同时可采用低速震荡辅助原生质体释放。
4. 酶解过程中可从酶解1 h起，每隔半小时进行观察，以观察到大量原生质体释放为原则，但不宜过长。
表2 常规组织类型酶解液及参考文献
三、原生质体纯化
将酶解后的组织液过尼龙网膜，去除未充分消化的组织碎片，选择与原生质体等渗的buffer清洗原生质体两次，离心去除碎片（一般采取50-100 g，离心1-2 min左右），最后将原生质体重悬于适当浓度甘露醇中。可参考以下方法来降低原生质体悬液中的碎片占比：
1. 提前优化样本，比如剥去外皮（仅限于研究对象不包含外皮部分的样本）、弃去质地坚硬的组织和损伤组织。
2. 降低离心转速和时间，去除留在上清中的碎片。
3. 如果原生质体起始量足够大，可考虑通过流式分选去除碎片。
图2 纯化过程中的拟南芥叶片原生质体悬液
四、细胞计数与活率检测
使用血球计数板对原生质体进行计数，观察破壁情况和原生质体状态，检测细胞碎片率，台盼蓝染色后，检测原生质体活率。下图是分离拟南芥叶片原生质体后的血球计数板镜下结果：原生质体活率98% ，碎片率低于10%。
图3-1 拟南芥叶片原生质体质检（放大倍数20×）
图3-2 拟南芥叶片原生质体质检（放大倍数40×）
参考文献：
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