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研究概述：铜死亡是一种新型的程序性细胞死亡（PCD），与细胞三羧酸循环和细胞呼吸密切相关，而缺氧可以调节PCD。然而，它们对肿瘤亚型的综合贡献仍未被探索。作者对TCGA_COADREAD进行分类。该分类在三个结直肠癌（CRC）队列中得到验证，并扩展到泛癌分析。结果表明，泛癌，包括CRC，可以分为三个不同的亚组。在CRC中，CHSs在预后和对经典药物的敏感性方面存在显著差异。此外，马西替尼和辛伐他汀分别对CHS1和CHS3有特殊影响。分类模型基于小细胞分裂和缺氧，适用于大多数泛癌，并有助于个性化的癌症治疗。
本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。
肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。可以用于分型的基因集很多，比如焦亡，坏死性凋亡，铁死亡，自噬，铜死亡，m7G，细胞衰老，r乳酸化修饰，糖基化修饰，各类代谢等等。
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流程图
研究结果：
一、铜死亡-缺氧亚型的建立
使用无监督聚类，TCGA_COADREAD患者根据与铜死亡和缺氧相关的关键基因被分为三个聚类，即CHS1、CHS2和CHS3。
二、突变特征
单核苷酸多态性（SNP）特征在CHS中排名前10的基因中存在差异（图2A）。作为CRC中不利的预后因素，CHS1和CHS3的Braf突变率分别为3.7%和17.3%，表明CHS3的预后不佳（图2B）。验证集中验证了CHS中Kras和Braf的突变趋势（图2C）。
拷贝数变异（CNV）分析表明，CHS之间的异常扩增和缺失各不相同（图2D）。通过GO富集分析，发现CHS1中的位点被富集用于循环免疫球蛋白、适应性免疫反应等。CHS2的结果包括mRNA剪接和对INF_a的细胞反应，而CHS3的结果是脂质代谢和内源性凋亡等（图2E-G）。
三、通路分析
亚型之间几乎所有Hallmark通路都存在显著差异（图3A）.作者基于GO基因集执行了GSVA，以进一步分析多种生物性状。如图3B所示，在增殖、血管生成、入侵、干细胞性和免疫力方面存在差异，所有这些在CHS1和CHS3之间都更明显。
为了探索CHS1和CHS3之间的差异，作者首先进行了差异分析来识别DEG，并在此基础上进行了GO分析。结果表明，DEG主要富含转移和免疫相关途径（图3C）。GSEA分析显示，具有经典生物特征的代表性通路在CHS3中更活跃（图3D），这也验证了GSVA的结果（图3B）。
共识分子亚型(CMS)可能是CRC最可靠的分类，将患者分为4个集群，即具有超突变和免疫激活的CMS1；具有标记WNT和MYC信号激活的CMS2；具有明显的代谢失调的CMS3；以及具有突出TGF-β激活、基质侵袭性血管生成和预后不良的CMS4 。如图3E，CHS1主要对应于CMS2和CMS3，CHS2没有倾向性分布，CHS3主要属于CMS4，这与CHS的标志性特征和预后特征一致。
四、CHS的代谢概况
与铜死亡密切相关的TCA循环和硫辛代谢在CHS1中更加活跃（图3F，3G），这与它们和铜死亡之间的生理关系相对应。
五、CHS中的免疫景观
TIMER的结果显示，CHSs之间的六个主要免疫细胞簇差异很大，在CHS3中含量最高（图4A）。CSH3中癌症相关成纤维细胞（CAF）的比例也高得多（图4B），与标志和CMS结果一致。使用ESTMATE算法来评估TME的整体状态（图4C），从ESTIMATE获得的三个指标在CSH3中最高，表明CHS3中的免疫细胞和基质成分相对更丰富。CHS3的肿瘤纯度最低，与估计得分的得分为负。
作者测量免疫检查点阻断（ICB）相关分子的表达，表达在CHS3中最高（图4D）。根据Fegs（功能性基因表达标志）将TME分为四种不同的亚型。Fges在三个亚型中的特征是不同的（图4E）.CHS1主要属于D和IE亚型，CHS3主要属于IE/F和F亚型，这表明CHS3高度纤维化，对免疫治疗反应不佳（图4F）。
六、在单细胞层面检查亚型的特征
单细胞数据集中获得了2212个肿瘤细胞（图5A），一些关键基因的表达显示出明显的差异。例如，ATP7B和SLC31A1几乎完全在肿瘤细胞中表达。一些基因，如SLC2A3和RORA，在肿瘤细胞以外的其他细胞中高度表达（图5B）。
TCA循环和硫辛酸代谢在CHS1中比在CHS3中更活跃，其他代表性特征在CHS3细胞中比在CHS1中更强（图5C-E）。
七、CHSs中微生物群的DNA甲基化模式和特征
CHS3中的F.n（具核梭杆菌）丰度明显更高（图5F）。LBP、MD2、TLR4和CD14负责一般的细菌效应，它们在CHS3中的表达要高得多，与F.n的丰富度一致（图5G）。基于对细菌反应基因集的GSEA表明，每个途径的p值小于0.05（图5H），表明组织中的F.n可能会改变多种信号通路的转导，从而影响CRC的肿瘤发生和进展。
八、泛癌分析
鉴于铜死亡和缺氧都是非癌症特异性的，我们接着探讨上述分类是否适用于其他癌症。结果发现大多数肿瘤的评分特征与CRC相同—铜死亡评分在CHS1中最高，在CHS3中最低，而乏氧评分则相反（图6A）。
在几乎所有癌症中，CHS3都表现出更活跃的细胞增殖、转移、免疫破坏和血管生成，而CHS1具有更强的逃避生长抑制和能量代谢失调的能力（图6B）。
大多数肿瘤的代谢特征与CRC具有相同的趋势——除了聚糖生物合成外，物质代谢在CHS1中最为活跃（图6C）。
在大多数带有TIMER的癌症类型中，六种免疫细胞的CHS之间存在明显差异，趋势与CRC相同（图7B）。根据Fges将泛癌的TME分为四种亚型，并将其与CHS进行比较，对应关系与CRC一致。大多数CHS1属于D亚型，而CHS3属于IE/F或F亚型，这证实了CHS3中TME的高纤维化（图7C）。
十、临床应用中聚类的探索
作者从Drugbank检索了CRC药物的目标分子，并专门分析了它们在CHSs中的表达。CHS中化疗药物和靶点药物的多种靶点的表达存在明显差异（图8A）。CHS3中靶分子表达较高，可能从药物中受益更多。
类器官样本通过转录组学数据成功分类为CHS，IC50值与DrugBank的预测一致。CHS3对氟和SN38（体内伊立替康的活性形式）最敏感，而CHS1相对不敏感（图8B）。临床CSH3患者化疗效果更好（图8C）。
进行新药预测与细胞验证，IC50结果显示，除了佛司可林、帕佐帕尼布和MK-0752，大多数药物对CRC细胞有很强的细胞杀伤作用。在其余的药物中，大多数用于细胞系的IC50s与预测的趋势一致——CHS3的敏感药物在HCT116和SW620中的IC50值较低，而CHS1的敏感药物相反（图8D）。大多数药物对两种细胞亚型的迁移具有不同的影响（图8E，F）。对CHS3敏感的药物在更大程度上削弱了HCT116和SW620的迁移能力。菌落形成呈现出类似的趋势（图8G，H）。生存分析表明，CHS1的预后最好，而CHS3的预后最差（图8I）。验证实验观察到相同的生存趋势（图8J）。
研究总结：本研究中，作者对CRC进行了多组学分析，将患者分为三种特征的亚型，并同样适用于泛癌，每个CHS的一般生物过程和免疫概况在泛癌中是相似的。对于CRC，化疗和靶向治疗在CHS3中更有效，改善缺氧可能会进一步促进这些影响。对于大多数泛癌病例，CHS3可能会在抗纤维化和抗缺氧条件下从ICB治疗中起到很大帮助。
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