自2009年首篇单细胞RNA测序的文章报道以来，单细胞测序技术不断普及与发展，多种不同发展方向的单细胞测序技术也不断问世。其中，由瑞典路德维格肿瘤研究所的Rickard Sandberg教授所开发的SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）及其之后的改良版本Smart-seq2被广泛应用于各领域中。
目前，百奥智汇可提供Smart-seq2单细胞全长转录组测序服务。本期我们就依次从技术概况、核心原理&实验流程、应用领域及案例、样本准备及运输注意事项等方面，为大家详细介绍和解析Smart-seq2单细胞全长转录组测序技术。
技术概况
什么是Smart-seq2单细胞全长转录组测序技术？
Smart-seq2是一种在全转录组范围进行单细胞RNA测序的方法。该方法由Smart-seq改良而来。Smart-seq2与目前最主流的10x Genomics单细胞转录组测序技术在技术层面是一致的，都是对单细胞水平下的转录组进行测序，但两技术所得的测序结果则各有特点。2019年，张泽民教授系统地将10x Genomics Chromium与Smart-seq2进行了比较分析，发现Smart-seq2技术具有更高精度、更高覆盖率和更高灵活性等特点（详见上期文献解读）。具体来说，该检测技术的开展具有很高的灵活性，可以对未知mRNA序列的样品进行检测，且最低支持单个细胞或最低10pg的RNA总量为模板。检测的覆盖率与灵敏度达到检测到转录因子等低丰度基因的标准。在单细胞水平下进行的高精度的全长mRNA测序，使研究者能够在单细胞水平进行基因表达检测、差异分析、可变剪接、融合基因等遗传调控信息分析，从而达到分析细胞类型、状态和谱系，对细胞异质性和转录调控机制等进行更深层次的探究。
核心原理&实验流程
Smart-seq2测序技术的高覆盖率与高精度是如何实现的？
Smart-seq2的基本实验流程包括单细胞分选、反转录（第一链合成）、模板置换（第二链合成）、cDNA扩增、文库构建、上机测序以及生信分析的过程。
图2 Smart-seq2的基本实验流程
具体而言，先使用流式细胞仪或者显微切割等方法获取单细胞并置于微孔板中，然后进行细胞裂解。随后在裂解液中加入含有oligo（dT）的引物反转录合成cDNA。合成过程中，逆转录酶在达到mRNA 5’末端时碰到真核mRNA特有的帽子结构，会连续在末端添加几个胞嘧啶，生成第一条链。然后，添加含有oligo（dG）的引物并退火，结合在第一条链的3’端与poly（C）杂交，合成第二条链。这样得到的cDNA经过PCR扩增，即可获得ng级的DNA，再利用改造后的高活性Tn5转座酶对DNA进行打断，同时将接头添加到cDNA的两端已进行标记。标记完成后的DNA片段通常在200-600 bp。然后再进行最后一次PCR扩增后，即可上机测序。
图3 Smart-seq2的模板转化过程示意图
在本技术中，最核心的原理在于首先使用了莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶（MMLVRT），该逆转录酶不仅具有逆转录活性，还具有模板转换以及末端转移酶的活性，能在反转录的过程中往新合成的cDNA的3’末端添加几个胞嘧啶。其次，在于模板置换的过程中使用了独特的模板转换寡核苷酸（TSO）作为模板转换的靶点。上述两大核心原理使Smart-seq2全长转录组技术具有更高覆盖率和更高精度的单细胞转录组cDNA序列的检测特点。
应用领域
肿瘤治疗和免疫系统发育等领域
✦应用实例：结直肠癌肿瘤微环境
淋巴细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中有着核心作用。其中，T细胞的状态转化一直是研究中的难点。2018年张泽民教授在Nature发表了以“Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer”的研究性论文。该研究基于Smart-seq2单细胞转录组测序技术得出的数据开发了STARTRAC这一分析工具，对结直肠癌病人癌组织，癌旁组织以及外周血中鉴定的20类不同类型T细胞进行单细胞水平的追踪，对其组织分布特性、克隆性、迁移性和状态变化特性进行了系统性地定量刻画。
图4 基于Smartseq2测序和STARTRAC算法对T细胞进行动态描绘
该文对结直肠癌T细胞进行单细胞研究，系统性地描述结直肠癌相关T细胞的组织分布特性、克隆性、迁移性和状态转化。利用T细胞受体（TCR）作为标签，研究团队发现肿瘤微环境和TCR共同影响了肿瘤浸润CD8效应记忆T细胞向耗竭性T细胞和效应T细胞的转化。
✦应用实例2：肝癌免疫微环境
肝细胞癌是世界范围内死亡率排名第三的癌症，其中中国的肝癌发病率居世界之首。免疫逃逸被认为是癌症发展的标志之一，目前研究表明，肿瘤存在多种免疫逃逸机制，提出了研究肿瘤微环境中不同免疫细胞状态的重要性。而不同类型的单细胞测序技术则是研究不同类型免疫细胞的状态和动态的有力手段。2019年，张泽民教授在Cell上发表了以“Landscape and dynamics of single immune cells in Hepatocellular Carcinoma”为题的研究性论文，展示了Smart-seq2与10x Genomics Chromium 3’联合测序的经典示范。该研究结合两种单细胞RNA测序技术，从5个免疫相关部位（肿瘤、邻近肝、肝淋巴结、血液和腹水）制备了CD45+免疫细胞转录组。一簇LAMP3+树突状细胞(DCs)似乎是传统树突状细胞的成熟形式，具有从肿瘤迁移到干淋巴结的潜力。LAMP3+树突状细胞也表达多种免疫相关配体，并表现出调节多种亚型淋巴细胞的潜力。发现肝癌肿瘤中的巨噬细胞呈现两种不同的状态：TAM-like和MDSC-like状态，其中SLC40A1和GPNMB与不良预后相关联。此外，研究还发现腹水中的髓系和淋巴细胞主要与肿瘤和血液来源有关。
图5 基于Smart-seq2肝癌免疫微环境中DC细胞的基因表达热图与LAMP3+DC细胞鉴定
该项研究首次对肝癌临床样本进行包括病理组织在内的多组织位点的收集，并利用前沿的生物信息学分析方法，通过自体对照，不仅描述了肝癌微环境的免疫组分和状态，而且描绘了肿瘤浸润免疫细胞跨组织的动态过程。此项国际领先的开创性工作，为人们研究肝癌和其他疾病中的免疫细胞，以及开发新的临床检测与治疗方案提供新的思路。
组织、血液及细胞等新鲜样品的样品准备
如何准备一个合格的Smart-seq2样品？
样本的来源及类型
人或小鼠的新鲜样本，包括组织、细胞系、外周血单核细胞等。其他物种请于实验前沟通。
样本要求
流式分选时去除黏连后活细胞占总细胞比例应大于60%，分群比较明显。调整位置确保细胞能够达到每个孔径中心，每分完一板细胞立即运输至百奥智汇或放入-80℃冰箱。
样品寄送
送样请至少提前一天告知；百奥智汇将寄送实验所需试剂和耗材至需求方，待流式细胞术分选完后立即运输至公司，或于-80℃冰箱保存一夜后，密封好置于充足干冰上运输。
注意事项
✦前期组织样品消化和目的细胞分选/富集请由需求方完成，细胞分选到96孔板后由百奥智汇接收开展后续单细胞测序实验。
✦因目的细胞不同，采用荧光定量PCR检验cDNA合成成功与否所需的引物不同，建议需求方自行设计目的细胞特异性的验证引物并合成。
✦根据经验，SMART-seq2单细胞转录组测序最终可获得的有效细胞数并非100%，需求方使用流式细胞术收集细胞时请提前与百奥智汇沟通以确定采集的单细胞数量。
参考文献：
Ramskold, D., et al., Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol, 2012. 30(8): p. 777-82.
Picelli, S., et al., Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods, 2013. 10(11): p. 1096-8.
Wang X, He Y, Zhang Q, et al. Direct comparative analyses of 10x genomics chromium and smart-seq2[J]. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2021, 19(2): 253-266.
Zhang L, Yu X, Zheng L, et al. Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer[J]. Nature, 2018, 564(7735): 268-272.
Zhang Q, He Y, Luo N, et al. Landscape and dynamics of single immune cells in hepatocellular carcinoma[J]. Cell, 2019, 179(4): 829-845. e20.
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