Alterations in the gut microbiome and metabolism with coronary artery disease severity
一.过程
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①将161例冠心病患者随机分为稳定型冠心病(SCAD)组、不稳定型心绞痛(UA)组、心肌梗死组(MI)40例。
②我们构建了一个由274个OTU组成的共丰度网络，并将它们聚为24个共丰度组(CAGS)，并识别出不同cad组之间显著不同的重要的CAGS。
③进行了一个“交叉比较方案”，以确定在不同的群体血清代谢物的特点。将血清代谢产物归纳为共丰度代谢模块，筛选出与cad表型显著正相关或负关联的干扰特征。
④鉴定肠道微生物组成、宿主代谢谱和主要cad表型之间的相关性分析。
⑤利用验证队列中最重要的CAGS和Metabotypes，对交叉验证的随机森林分类器的ROC进行了分析，对各个组之间（Con VS CAD, Con VS SCAD, SCAD VS UA， SCAD VS ACS, UA VS MI）进行分类辨别。
二.结论
① 通过对160名冠心病患者和40名健康人进行多组学分析，发现肠道菌群和血清代谢物随着冠心病（CAD）严重程度发生变化；
② 确定了与CAD严重程度相关的29个血清代谢物模块；
③ 分析并鉴定了与CAD严重程度相关的肠菌CAG；
④ 特定菌群可能通过影响宿主的代谢途径，影响患者动脉粥样硬化严重程度；
⑤ 基于上述微生物和代谢物所构建的疾病分类器，不仅可以在另一验证队列中准确区分疾病与健康人群，甚至可以用于鉴别不同的冠心病亚组。
三.方法
1.全代谢组分析
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（1）使用SIMCA-P
（2）多元统计分析方法，并用交叉验证模型的有效性
1）PCA分析
无监督算法，只有一个数据集，分类对数据没影响，不利于发现组间差异
2）PLS-DA分析
有监督算法，人为加一个数据集，减小组内差异，类似于PCA
3）OPLS-DA分析
将PLS中y数据集减少为只有一个变量，而这个变量在比较的两组中的值被设定为一个极大一个极小。因此将原始数据矩阵X中系统差异分为两个部分，一部分变量与回归矩阵Y线性相关，另外一部分变量与回归矩阵线性无关。
具体为有两种主成分，即预测主成分（只有一个）和正交主成分（可以多个），将组间差异最大化反应在t1上，而正交组成分反应组内差异。
（3）代谢组学单变量差异分析
1)T检验：适用于两组样本方差齐性，常用火山图
2）ANOVA：适用于三组以上样本各组样本方差齐性，常用趋势图
（4）VIP：判断单个自变量在解释因变量时的重要性，衡量代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响，辅助标志代谢物的筛选。
（5）通路富集分析
运用HMBD、KEGG、LMSD等进行ORA\FCS分析
（6）代谢通路可视化
（6）化合物ID转化
2.高含量血清代谢产物的聚类研究
3.粪便样品中提取DNA和16S rRNA基因v3-v4区域测序细菌DNA
制备了16S rRNA基因v3-v4区的测序文库。用Illumina miseq系统将纯化的产物按同等比例混合测序。
4.测序数据分析
（1）USEARCH v.8.0
（2）RDP classifier
系统差异分析，匹配测序深度的差异。
（3）Qiime v1.8.0：
α-和β-多样性分析。对香农指数、the observed OTUs, and Chao1 index 进行评价。利用归一化的TOU丰度表进行β-多样性分析，包括基于Bray-Curtis的主坐标分析、加权的unifrac和未加权的unifrac距离。
（4）PERMANOVA
检验统计学效应
（5）Adonis检验
计算我们收集到的每一个宿主因子所解释的变异。
5.SparCC产生微生物群
找到CAGs，并利用WGCNA进行Ward clustering algorithm。
6.Spearman多关联分析
用r计算CAGS、血清代谢物模块和临床参数之间的Spearman相关关系，用Wilcoxon秩和检验CAGS和cad相关代谢型的差异丰度。Benjamini-Hochberg控制FDR。
7.随机森林模型进行特征选择
利用CAGS模型和代谢物模型，将发现阶段样本随机分为训练集和测试集。对70%的样本进行随机森林分类器训练，并在R.中使用随机森林包对其余30%的样本进行测试，然后在该模型的基础上使用另一个独立的队列进行进一步的预测。我们在训练集中使用了十倍交叉验证。在最小交叉验证误差下，我们建立了一组最优变量集，最重要的变量建立了预测模型。当将较小的模型应用于测试集时，将其作为AUC进行性能测试，并利用pROC r软件包计算了ROC曲线的置信区间。
参考
（1）https://www.jianshu.com/p/e291250595b9
（2）http://www.sohu.com/a/323169773_785442
（3）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6486680/#CR72
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