题目：Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Disease-Defining T-cell Subsets in the Tumor Microenvironment of Classic Hodgkin Lymphoma
发表期刊：Cancer Discovery (IF:39.4)
发表年份：2020-03

摘要

霍奇金淋巴瘤( Classic Hodgkin Lymphoma, cHL)的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由不同类型的非恶性的免疫细胞和恶性细胞(HRS)组成的。细胞成分及其空间关系的特征对于理解TME中的 cross-talk和治疗靶向至关重要。作者对22个霍奇金淋巴瘤组织标本和5例健康对照淋巴结组织进行单细胞转录组测序，总共包含127000多个细胞，首次在单细胞水平揭示了霍奇金淋巴瘤特异性免疫微环境的表型。单细胞表达谱确定了一种新的霍奇金淋巴瘤相关T细胞亚群，该亚群高表达LAG3，确定该LAG3+T细胞群是免疫抑制环境形成的中介物质。微环境中免疫细胞的Multiplexed spatial assessmen评估也显示，MHC II类缺陷肿瘤细胞附近的LAG3+T细胞增加。这些发现为TME生物学提供了新的见解，并为霍奇金淋巴瘤的免疫检查点靶向提供了新的方法。

实验设计及质控

结果

1.单细胞水平的cHL特异性免疫微环境

总共22例cHL患者的淋巴结单细胞悬液，包括12例结节硬化（NS）亚型、9例混合细胞（MC）亚型和1例富含淋巴细胞亚型。同时还有5个健康供者的反应性淋巴结（RLN）进行了测序，作为正常对照）。总共得到127786个活细胞，每个细胞检测到的基因数目中位数是1203。合并了所有细胞（保活cHL和RLN）的表达数据，并进行了批量校正和标准化。最终确定了22个细胞簇(Figure 1A),包括 naïve T-cell clusters, two CD8+ T-cell clusters, six CD4+ T-cell clusters, seven B-cell clusters, one macrophage cluster, one plasmacytoid dendritic cell cluster, and one progenitor cell cluster.大多数免疫细胞表型在cHL和RLN之间均有所重叠，一些特定的细胞簇主要来自cHL。 Figure 1 A and B 而且，与RLN相比，3个Treg 细胞群在cHL样本数目更多，比例更高(Figure 1 C-E)。 Figure 1 C-E

2.EBV状态对cHL免疫细胞亚群的影响

30%至40%的cHL与EB感染HRS细胞有关，EBV感染可以招募特定的Treg群体到cHL的TME中。于是比较了5个EB+和17个EB-样本，发现在EBV+cHL中，具有Th17特征的CD4+T细胞比例显著降低（Figure 1 F and G）。然而，两组之间的CD8+T细胞或Treg比例没有显著差异（Figure 1 F）。类似地，与cHL NS亚型相比，通常与EBV相关的cHL MC亚型的Th17比例较低(Figure 1 H)。 Figure 1 F and G

2.cHL特异性免疫亚群的单细胞图谱

Figure 1B 和D 表明，与RLN相比，cHL中的Tregs较多。于是将分析重点放在Treg亚群上。除IL2RA（CD25）和TNFRSF18（Figure 2A）等常见Treg标记物外，CD4-CD5-Treg亚群还高表达LAG3。然而，其他典型的Treg 细胞marker，如FOXP3在该亚群中表达较低，表明这些细胞可能是I型调节性（TrI）T细胞表型（图2B）。为了证实cHL中免疫细胞的表达模式，还使用多色IHC和IMC评估了所有cHL病例中胞面和胞内marker的表达。证实了CD4+T细胞上的LAG3和FOXP3蛋白质表达水平呈负相关。（Supplementary Figure 6 B and C）。 Supplementary Figure 6 B and C 为了进一步了解cHL TME中抑制性受体表达的特点，探索了单个T细胞之间的表达模式。发现有LAG3表达的细胞多来自Treg，有PD-1表达的细胞比较多来自非Treg的CD4+T细胞 (Figure 2 C). 有趣的是，CD8+T细胞（包括CTL）不是表达PD-1和LAG3的主要群体 (Figure 2 C and D)。这表明cHL中，CD4+T细胞群体对于免疫检查点调节的重要性。值得注意的是，每个抑制性受体在cHL的每个T细胞亚群中的作用具有特异性(Figure 2 E) Figure 2 C Figure 2 D and E 大多数LAG3+T细胞共表达CTLA4，CTLA4是一种更普遍的Treg标记，而PD-1则没有这种现象（Figure 2 F）。接着使用了 diffusion map algorithm分析所有CD4+T细胞亚群的分化状态。第一维度显示出naive T细胞开始到Tregs T细胞的分化轨迹结束的轨迹。LAG3+T细胞在该维度的远端富集，这说明这群细胞与代表终末分化特征的基因相关。与之前的报道一致，LAG3阳性的细胞增殖活性下降，抑制活性增强，与G2–M细胞周期和糖酵解特征基因相关。 Figure 2 F and G

3.cHL细胞上清能诱导LAG3+ T Cells增殖

接着研究了LAG3+T细胞的细胞因子表达水平。在CD4+T细胞中，LAG3+T细胞的细胞因子IL10、TGFβ和IFNγ的表达高于LAG3− T细胞（Figure 3 A）。这些特征与1型调节性T细胞的特征一致。 Figure 3 A 接着假设HRS细胞产生的细胞因子或趋化因子可能影响cHL的TME。评估了各种淋巴瘤细胞系的上清液对T细胞体外扩增的影响。活化T细胞14天后，流式证实，与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系上清液或仅培养基共培养的T细胞相比，与cHL细胞系上清液共培养的CD4+CD25+T细胞上表达的LAG3水平较高（Figure 3 B and C). Figure 3 B and C Luminex分析表明，与DLBCL细胞系相比，cHL细胞系上清液有更的细胞因子和趋化因子，包括TARC/CCL17、TGFβ和IL6，它们是已知的Treg迁移和分化增强剂（Figure 3 D）。与scRNA-seq结果一致，与CD4+LAG3-T细胞相比，CD4+LAG3+T细胞分泌的IL10和TGFβ数量显著增加（Figure 3 E）。值得注意的是，体外共培养后，CD4+LAG3+T细胞抑制CD4+T细胞的增殖，证实了LAG3+T细胞的免疫抑制功能（Figure 3 F）。 Figure 3 D-F

4.LAG3+T细胞和HRS细胞的空间评估

接下来，探究LAG3+T细胞和恶性HRS细胞之间的空间关系。病人样本的IHC显示，与RLN相比，cHL TME中富含LAG3+T细胞，并且在一部分cHL病例中，HRS细胞被LAG3+T细胞紧密包围（Figure 4 A）。单细胞分析结果提示，与MHC II类阳性的HRS细胞（n=16）相比，MHC II类阴性HRS细胞（n=6）的LAG3表达显著更高，但与EBV状态或组织学亚型无关（Figure 4 B)。对于CD4-Treg-C5亚群，与MHC II类阳性细胞相比，MHC II类阴性细胞中LAG3上调倍数最大（Figure 4 C）。 Figure 4 A-C IHC表明，与MHC-II阳性的样本相比，MHC-II阴性样本LAG3+T细胞显著增加，FOXP3+T细胞减少（Figure 4 D）。多色IHC评估了HRS细胞和LAG3+CD4+T细胞之间的空间关系（Figure 4 E-G）。MHC-II阴性样本HRS周围区域的LAG3+T细胞密度显著增加，但与MHC-I状态、病理亚型或EBV状态均无相关性（Figure 4 E）。同样，在MHC-II阴性的cHL样本中，CD30+细胞（HRS细胞）与其最近的LAG3+T细胞之间的平均最近邻距离显著最短（Figure 4 F）。相反，在MHC-II阳性HRS细胞的样本中，围绕FOXP3+T细胞的HRS细胞数目较高（Figure 4 E），HRS细胞到FOXP3+细胞的最近邻距离也较短（Figure 4 F）。 Figure 4 E-G 为了进一步研究HRS细胞及其周围细胞之间的空间关系，使用IMC成像质谱流式方法，评估所有cHL病例中表面和胞内标记物的表达（这个技术允许在TME的空间背景下同时可视化35个蛋白质标记物）。与IHC分析一致，MHC-II阴性cHL样本有大量LAG3+CD4+细胞浸润，伴有较少的FOXP3+CD4+细胞（Figure 5 A）。相反，MHC-II阳性病例显示大量的FOXP3+CD4+T细胞和少量LAG3+CD4+T细胞。与MHC-II阳性cHL病例相比，MHC-II阴性cHL标本中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的最近邻距离明显缩短。 Figure 5 A-C ##5.在验证队列中，TME中LAG3+T细胞的数量与MHC-II表达的缺失相关

接下来，使用一个独立队列来验证LAG3+T细胞存在的潜在预后价值。这队列包括166名患者，进行了ABVD方案治疗(阿霉素、博莱霉素、长春碱和达卡巴嗪）。与scRNA-seq的结果一致，他们发现与MHC-II阳性HRS细胞相比，MHC-II阴性HRS细胞的肿瘤组织中LAG3+T细胞的比例显著高于MHC-II阳性中的HRS细胞，但与EBV状态无关（Figure 5 B and C）。此外，LAG3+T细胞数量增加与DSS和OSS缩短相关(Figure S13 A and B)。，高比例的LAG3+T细胞（>15%）和CD68+肿瘤相关巨噬细胞(≥5%）通过多变量Cox回归分析确定为DSS的独立预后因素（MHC-II表达和IPP评分作为协变量量，Figure S13 C）。最后在一个独立复发性cHL患者队列中（这些患者在接受高剂量化疗后进行自体干细胞移植），同样发现，LAG3+T细胞的增多与不良的存活率相关，尽管未达到统计显著性，可能是由于样本量太少（Figure S13 D）。

Figure S13 ##6.cHL中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的Cross-talk
cHL中HRS细胞与LAG3+T细胞之间的串扰
为了研究HRS细胞与cHL微环境相互作用，接下来探索了从原发性霍奇金淋巴瘤样本的显微解剖HRS细胞生成的Affymetrix基因表达数据。发现了MHC阴性样本的细胞因子和趋化因子的表达水平较高（图6A）。IL6是唯一一个在MHC-II阴性HRS细胞中表达显著高于MHC-II阳性HRS细胞的细胞因子。在体外，IL6也可诱导CD4+LAG3+T细胞形成（Figure 6B），表明IL6可能在诱导cHL中的CD4+LAG3+T细胞中发挥作用。 Figure 6 为了研究LAG3+T细胞和MHC-II在HRS细胞的相互作用，在L-428 cHL细胞系中敲除CIITA基因（因为CIITA是MHC-II表达的主要调节因子），并验证了敲除CIITA基因细胞上MHC-II呈阴性状态（Figure S14A）。 Figure S14A 接下来，使用L-428上清液培养从外周血单个核细胞（PBMC）中分离诱导的LAG3+T细胞。将LAG3+T细胞分别与野生型L-428细胞和CIITA敲除L-428共培养，发现LAG3的表达量在MHC-II阳性的L-428细胞中下调，表明MHC-II可以跟LAG3直接相互作用负调控LAG3+T细胞(Figure 6C)。 Figure 6

7.去除LAG3+T细胞后，临床样本来源的T细胞被激活

为了证实LAG3+T细胞在cHL临床样本中的致病作用，从4名患者的细胞悬液中分离了CD4+LAG3+CD25+T细胞和剩余的T细胞。然后在体外将T细胞与CD4+LAG3+CD25+T细胞共培养之后，
观察到与LAG3+细胞群共培养的T细胞中的增殖受到抑制，而不与LAG3+细胞群共培养的T细胞中，细胞增殖明显增强，且细胞内细胞因子TNFα的表达显著增加。

总的来说，MHC-II阴性HRS细胞的免疫抑制微环境是高度“有序”的，部分细胞由CD4+LAG3+T细胞诱导产生，而CD4+LAG3+T细胞又由HRS细胞产生的细胞因子和趋化因子诱导（Figure 7）。综合所有这些结果，作者推断LAG3+T细胞和HRS细胞之间的串扰可能是cHL免疫逃逸的一个重要机制，对检查点抑制剂治疗的结果预测具有潜在意义，包括反应持久性和克服耐药性。 Figure 7

研究意义

由HRS细胞的细胞因子和趋化因子诱导的LAG3+T细胞在cHL的TME中起着重要的免疫抑制作用。重要的是，LAG3是正在进行的恶性淋巴瘤临床试验（包括cHL）中的癌症免疫治疗靶点。该研究提示去除LAG3+群体可以作为重新激活T细胞活性的一种手段。虽然目前数据没有证明LAG3+T细胞作为预后生物标记物的价值，尚需要其他队列的进一步验证，但在针对LAG3+T细胞及其细胞相互作用的治疗背景下，评估LAG3+T细胞作为预测性生物标记物的潜力至关重要。特别是，正在进行的针对CTLA4或CD25的LAG3靶向抗体和抗体-药物结合物的试验（将针对LAG3+细胞等）将允许进行这种评估。此外，对包括LAG3+T细胞和其他免疫细胞类型等免疫细胞相互作用生物学的进一步研究，可能有助于未来替代检查点抑制剂的治疗开发。