更多精彩文章 生信人
更多个性化生信分析生信意向表单
表观转录组的情况非常复杂，迄今已描述了170多种不同类型的RNA化学修饰，以修饰编码和非编码RNA。目前，对这些修饰功能的研究正在兴起，并已显示出对人类病理有很大的影响。6-甲基腺苷(m6A)是mRNA中含量最丰富、特征较好的内部修饰，其作用是调节胚胎干细胞和癌细胞的自我更新，有利于热休克或DNA损伤后的生存。除了m6A修饰在mRNA中的作用外，m6A修饰还存在于非编码RNA中，如miRNA、lncRNA和circRNA，调节其生物发生和功能。RNA修饰精细调控的众多分子过程，从RNA代谢、衰变、剪接或翻译、定位、稳定性、周转、与RNA结合蛋白（RBPs）或其他RNA结合，从而使遗传信息多样化。与表观遗传学类似，已经发现了一组蛋白质，它们能特异性地 "write"（催化特定修饰的沉积）、"erase"（催化特定修饰的去除）和 "read"（识别和结合修饰的核苷酸）从而影响RNA的命运。最近记录到的mRNA中的其他修饰包括最近记录到的mRNA中的其他修饰包括：N6，m6Am，m5C，hm5C，pseudouridine，m1A。
RNA修饰也存在于其他调控性ncRNA中，实际上修饰最多的RNA是tRNA和rRNA，它们的修饰塑造了蛋白质的合成效率和保真度。已有100多种修饰被描述为tRNA，在翻译中起着准确、高效解码的关键作用。而在rRNA中，大多数修饰聚集在功能位点周围，包括解码位点和肽基转移中心(PTC)，表明其在调节蛋白质合成方面的功能相关性。
RNA修饰的沉积是动态的，适应不断变化的微环境，如应激或化疗药物的微环境的能力是确保肿瘤细胞存活的关键，表明RNA修饰可能在癌症中发挥重要作用。癌症从根本上被认为是一种以不同抑癌基因和肿瘤抑制基因的遗传或表观遗传改变逐步积累为特征的疾病。其中，表观遗传组学也可以在这种病理学中发挥基本作用。虽然RNA修饰一般不被认为是癌症的驱动因素，但累积的证据表明，它们的异常表达与生存、增殖、自我更新、分化、应激适应、侵袭和抗治疗等功能相关，而这些都是癌症的标志。多项研究都表明，异常RNA修饰有助于癌细胞的增殖、自我更新、迁移、应激适应和存活，并提示靶向癌细胞的异常转录后修饰可能有望成为肿瘤的有效治疗手段。
因此，我们下面将详细介绍RNA修饰(m6A、m5C和Ψ)在编码和非编码RNA中的分子和细胞功能，尤其是它们在癌症中的作用，并在此进一步总结它们在癌症中的异常沉积的治疗潜力。
(一)6-甲基腺苷（6-methyladenosine）
(1)编码和非编码RNA中的m6A修饰
N6-腺苷酸甲基化(m6A, N6-methyladenosine )是1974年首次发现的一种著名的转录后修饰，一直被认为是在从病毒到哺乳动物的mRNA中发现的最频繁的内部修饰，但在许多真核生物物种的小ncRNA和lncRNA中也会出现，并且这种修饰富集在3′非翻译区(3′UTRs)、停顿密码子附近、长内外显子内、基因间区、内含子和5'UTRs处。m6A检测的大多数方法依赖于使用识别m6A的特异性抗体免疫沉淀甲基化RNA，随后利用紫外线交联步骤将甲基化RNA与抗体结合的改进方法，使得能够在单核苷酸分辨率下识别m6A位点。
m6A修饰也可发生在ncRNA中，如miRNA、lncRNA和circRNA。在miRNA中的m6A修饰在pri-miRNA中，但不在pre-miRNA中，而且m6A标记通常位于基因间和基因内包含典型METTL3基序的pri-miRNA中。至于circRNAs，尽管来源于mRNA外显子，但m6A修饰的circRNAs经常来源于mRNAs中未有甲基化的外显子。LncRNAs中的m6A沿着转录本的整个主体分布，并且在经过可变剪切的lncRNA中存在较多。
i)m6A的编码器(Writer)
在转录过程中，m6A的沉积发生在新生的pre-mRNAs中，由甲基转移酶复合物在细胞核中进行。复合物包括METTL3、METTL14、RBM15、WTAP和KIAA1429，其中METTL3通过其甲基转移酶域催化腺苷向m6A的转化，METTL14负责识别RNA底物，RBM15负责复合物在mRNA中靶位点的初始招募，WTAP和KIAA1429负责复合物的形成。最近的研究还发现了ZC3H13在适配体RBM15和WTAP之间起桥梁作用，METTL16是人类细胞中另一种活跃的m6A甲基转移酶，其主要能甲基化snRNA、pre-mRNA中的一些内含子位点，此外还能甲基化其他ncRNA。
ii)m6A消码器(Eraser)
m6A的沉积是可逆的，依赖于特定甲基转移酶和去甲基酶或“Eraser”的协调和动态网络。目前m6A甲基酶有FTO和ALKBH5，其中FTO表现出对2 ' -二甲基腺苷(m6Am)脱甲基化的偏好，但也能脱甲基化m6A。此外， ALKBH3优先作用于tRNA中的m6A。
iii)m6A读码器(Reader)
m6A Reader结合蛋白的独特识别元件，驱动标记RNA发生的生化过程。部分Reader含有一个共同的RNA结合域--YTH域，其中包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。此外，还有eIF3、HNRNPC、HNRNPA2/B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、PRRC2A和 FMRP等。
(2)RNA中m6A沉积的分子功能
i)m6A在mRNA中的作用
关于m6A沉积的生物学功能，依赖于识别和结合修饰过的mRNA的蛋白质reader。例如，YTHDC蛋白亚型主要存在于细胞核中，特别是YTHDC1已被描述为pre-mRNA的可变剪切因子，其通过招募核转运受体或与m6A甲基转移酶结合TREX mRNA输出复合物和修饰mRNA来促进mRNA输出。而YTHDF蛋白亚型主要存在于细胞质中，并调节细胞质修饰的mRNA的结局。例如，YTHDF1和YTHDF3可以提高mRNA的翻译效率，YTHDF2通过CC4-NOT脱乙酰酶复合物促进mRNA的衰变。YTHDF3也可能通过与YTHDF2相互作用加速mRNA的衰变。YTHDC2蛋白可以存在于细胞核内外，能够选择性地与ncRNA的m6A标记结合，但结合后的生物学后果还尚不清楚。在胞浆中，YTHDC2影响其靶mRNA的翻译效率和丰度。迄今为止的证据表明，m6A沉积通过复杂的reader网络介导不同的效应，但最近的一项研究揭示了m6A的 reader统一功能模型的证据，m6A主要通过三个YTHDF成员reader的共同作用影响mRNA的降解。除此之外，研究也表明eIF3蛋白优先与mRNA的5′UTR内的m6A结合，导致翻译增强，IGF2BP能促进其靶向mRNA的稳定和储存。
ii)m6A在ncRNA中的作用
与mRNA相似，miRNA、lncRNA和circRNA上m6A的存在可以调节它们与m6A-reader的结合，进而调节它们的加工和成熟、丰度、翻译、稳定性、位置、功能或降解，也可以动态调节包括肿瘤发生在内的许多生理和病理过程。例如，METTL3对pri-miRNAs的甲基化可增加其与HNRNPA2/B1的结合，使DGCR8与pri-miRNAs发生相互作用并使之成为靶标，促进miRNA生物发生的启动及其成熟为miRNAs。METTL14可以直接将DCGR8招募到编码miR-126a的m6A修饰的pri-miRNA上，进而影响miR-126a的水平。此外，METTL14被发现在转录伸长过程中与染色质相关，这可能表明METTL14可能有助于复合物对pri-miRNA转录物的协同转录招募。因此，通过甲基化酶或Eraser差异表达改变m6A水平可能导致成熟mirna的显著变化。
正如最近报道所述m6A沉积可以改变lncRNA的稳定性。GAS5-AS1转录被ALKBH5调控时，m6A可提高其稳定性，然而m6A可通过YTHDF2和YTHDF3结合促进GAS5 lncRNA降解。虽然目前还不清楚lncRNA的定位是否也受m6A的调控，但已有研究表明，METTL3的过度表达可以显著增加RP11 lncRNA的核定位。lncRNA中m6A的修饰也可以影响其结构，影响RNA之间以及RNA与调节其特定生物学功能的蛋白质之间的相互作用。例如，发现HNRNPC与lncRNA MALAT1未甲基化的发夹相比，以 "m6A switch"调控的方式与m6A修饰的发夹结合，这表明m6A修饰破坏了lncRNA的发夹-茎结构，从而促进其与HNRNPC的结合。LncRNA XIST 被METTL3甲基化，在体外和体内实验中METTL3基因敲除均可损害XIST介导的X染色体上基因的转录沉默。细胞质lncRNA linc1281在其3′端区域被甲基化，甲基化标记是通过未知蛋白相互作用与let-7结合所必需的。
关于METTL16介导的snRNA沉积，初步研究表明U6 snRNA的A43位置甲基化，该位置位于pre-mRNA 5 '剪接位点碱基对附近区域，表明METTL16在mRNA剪接中起着重要作用。
有趣的是，ncRNA在调节m6A的甲基化水平方面也起着重要作用。例如，在分化的干细胞中，miRNAs会通过序列配对机制，调节METTL3与mRNA的结合，从而调节m6A的丰度。同样在肝癌中，抑制miR-145会导致YTHDF2表达增加，进而导致m6A水平下降，这可能是由于mRNA降解增加所致。
虽然目前对m6A沉积的功能还不完全了解，但研究逐渐表明m6A甲基化参与了mRNA加工、衰变、稳定性、剪接、多腺苷酸化、核输出和翻译等调控机制。在ncRNA中，m6A也被证明能促进其加工或增强其功能。
(3)m6A在癌症中的作用
许多研究表明，m6A在RNA中的沉积在许多生理过程中起着关键作用，包括昼夜节律调节、精子发生、胚胎发生、DNA损伤和应激反应、多能性和细胞重编程。此外，新出现的证据表明，m6A调节因子还与恶性肿瘤的增殖、肿瘤发生、侵袭、转移或免疫系统逃避等致癌或抑瘤功能密切相关。下面，我们总结了m6A中编码器(Writer)、消码器(Eraser)和读码器(Reader)在癌症中的主要新角色（表1）。
更多精彩文章 生信人
更多个性化生信分析生信意向表单
i)m6A Writer在癌症中的作用
据报道，METTL3和METTL14的表达可促进多种癌症类型的肿瘤发生。例如，METTL3在急性髓性白血病（AML）中过度表达，被证明可以甲基化BCL-2、PTEN和c-Myc mRNA，导致其翻译增加，抑制细胞分化和凋亡，促进白血病进展。然而，m6A依赖的翻译机制仍未确定。此外，另一项研究发现，METTL3在体内的表达对于维持AML细胞处于未分化状态，从而维持骨髓性白血病的生长至关重要。
相比之下，METTL14在AML中通过增加MYB和c-Myc mRNA的稳定性和翻译来作为抑癌基因。METTL3作为癌基因，通过促进EGFR和TAZ的翻译，促进肺癌和结肠癌中细胞的生长、存活和侵袭。METTL3在乳腺癌中也被上调，它能增加HBXIP mRNA的甲基化和稳定性，通过抑制肿瘤抑制因子let-7 g诱导细胞增殖和肿瘤细胞的存活。
最近的研究表明，在结直肠癌中也观察到m6A修饰物的异常过度表达，m6A的异常沉积增加了miRNA-1246的表达，导致肿瘤抑制因子SPRED2的下调和转移。最近的其他研究报道，METTL3在前列腺癌细胞中过度表达，通过SHH-GLI1信号传导，促进癌细胞的生长和侵袭。此外，METTL3还能调节ITGB1的表达，从而影响其与Collagen I的结合、肿瘤细胞的移动性，促进前列腺癌骨转移。
尽管METTL3和METTL14在所有这些癌症类型中具有一致的致瘤功能，但在胶质母细胞瘤和肝癌中，一些报告显示两者都具有致瘤和抑制肿瘤的两种作用。最初的研究表明，m6A甲基化通过降低ADAM19等关键致癌转录物的稳定性和表达，抑制胶质母细胞瘤干细胞的生长、自我更新和肿瘤发生，而也有研究发现METTL3可以增加SOX2 mRNA的稳定性和表达，促进胶质母细胞瘤干细胞的生长，并延长小鼠的生存期。同样，在肝癌中，m6A Writer的表达可以反过来促进或抑制肿瘤的发生。例如，METTL14最初被确定为肝癌中的肿瘤抑制因子，METTL14的表达会诱导pri-miR-126的表达增加，抑制肿瘤转移。相反，在另一项研究中发现METTL3上调，与肝癌患者预后不良有关。
在另一项研究中，METTL3通过m6A-YTHDF2依赖的方式抑制SOCS2 mRNA的表达。从报道的数据可以得出结论， m6A Writer及其结合因子、Eraser和Reader的不同表达可能是导致m6A沉积水平差异以及靶向RNA差异的原因，而这又将导致观察到的差异和争议。因此，还需要更多的研究来准确确定在胶质母细胞瘤和肝癌中METTL3和METTL14的性质，并识别导致这一争议性发现的因素、途径或肿瘤细胞状态。
在其他肿瘤中，METTL3和METTL14起着抑制肿瘤的作用。例如，在子宫内膜癌中，70%的肿瘤通过METTL14突变或METTL3表达下调表现出m6A水平的降低。METTL3-METTL14复合物缺失通过上调AKT通路成员的表达导致细胞增殖增加，从而在子宫内膜癌中表现出肿瘤抑制功能。同样，在肾细胞癌中，METTL3的缺失通过激活PI3K-AKT-mTOR通路促进细胞增殖、生长和集落形成，并通过上皮间充质转化(EMT)通路增强细胞迁移和侵袭。
METTL16在癌症中的意义还不明确，只有少数研究将METTL16与癌症联系起来。最近的研究，在结肠癌中发现了功能缺失突变和表达改变，这表明METTL16在结直肠癌的肿瘤发生中具有一定的作用。另有研究将METTL16与MALAT1 mRNA的成熟相关联，MALAT1 mRNA在不同类型的癌症中可作为癌基因和肿瘤抑制因子。此外，考虑到METTL16在调控snRNA甲基化，进而调控其加工过程中的作用，METTL16的失调可能通过诱导替代性剪接的变化而有利于肿瘤的发展。
ii)m6A Eraser在癌症中的作用
已发现m6A Eraser的失调也与癌症风险相关，FTO多态性已被认为与包括癌症风险增加在内的多种人类疾病相关。在发现FTO催化活性后，我们开始了解FTO致癌活性的分子机制。初步研究表明，FTO在AML中高表达，并通过降低肿瘤抑制因子RARA和ASB2的mRNA中的m6A水平，导致其表达受到抑制，从而发挥其致癌功能。
同样，FTO通过调节ADAM19，诱导GSCs生长、自我更新、肿瘤进展，并与不良生存期相关。最近的研究将FTO的表达增加与其他肿瘤联系起来。例如在黑色素瘤中，FTO的表达通过直接去除PDCD1、CXCR4和SOX10 mRNA中的m6A，从而增加它们的稳定性，促进肿瘤的发生和对免疫治疗（抗PD-1）的抵抗。
FTO在宫颈癌中也被上调，FTO诱导了对化疗放疗的抵抗，并增强了对DNA损伤的反应。此外,FTO可以激活β-catenin通路，增加ERCC1的表达，而ERCC1的表达与宫颈癌预后恶化有关。此外，FTO通过对E2F1和MYC的正向调控促进细胞迁移和增殖。在肺癌中发现FTO过量表达，并与较差的预后有关，通过调节MZF1的表达促进细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡。在乳腺癌中，高水平的FTO也通过下调BNIP3的表达，在体外和体内促进细胞增殖、菌落形成和转移。令人信服的证据清楚地表明了FTO在癌症中的作用，然而虽然已经描述了FTO可以去除肿瘤抑制因子或基因mRNA中的m6A，从而赋予免疫治疗的抗性，但目前还没有足够的证据证实在癌症中检测到的作用完全是由于其去甲基化酶的活性。
第二种被发现的m6A脱甲基酶ALKBH5的异常过表达也与多种癌症类型有关。在胶质母细胞瘤中发现ALKBH5过度表达，其表达与较差的预后有关，它通过增强FOXM1的表达促进GSCs增殖和肿瘤进展。在乳腺癌中，ALKBH5通过降低KLF4和NANOG mRNA的腺苷甲基化，增强其在乳腺癌干细胞中的稳定性，促进肿瘤的发生。在胃癌中，它通过去甲基化lncRNA NEAT1促进侵袭和转移。在卵巢癌中也发现ALKBH5表达增加，其表达与生存率较差相关，其表达上调通过mTOR和BLC2-Beclin1途径促进增殖、侵袭和自噬。与其他m6A调节剂类似，ALKBH5在其他肿瘤中也被证明具有抑制肿瘤的作用。例如，在胰腺癌细胞中，ALKBH5的丢失会诱导lncRNA KCNK15-AS1的甲基化增加，导致其下调和细胞迁移增加。胰腺癌中的ALKBH5也被证明可以通过降低WAF-1水平和阻碍Wnt信号激活来抑制肿瘤的发生。
iii)m6A Reader在癌症中的作用
m6A Reader在癌症中也异常表达，其功能缺陷与致癌或抑瘤作用有关，然而我们现在才开始了解这些RNA结合蛋白、m6A和癌症的相互作用。YTHDC2和YTHDF1在结直肠癌中过度表达，两者都与患者的不良预后和高细胞增殖及转移潜力有关，其中YTHDC2调节HIF1A等肿瘤启动子基因的表达，沉默YTHDF1可通过抑制Wnt-β-catenin通路，抑制体外肿瘤的发生性和体内肿瘤的生长，其表达可诱导对化疗的抵抗。YTHDF1在癌症中也被上调，特别是在卵巢癌中，YTHDF1可增加EIF3C的翻译，促进肿瘤的发生和转移。而在黑色素瘤中，YTHDF1则作为一种肿瘤抑制因子，它能促进肿瘤抑制因子HINT2的翻译，从而抑制肿瘤的发展。YTHDF2在AML中的过度表达被证明可以降低各种含m6A的转录物的半衰期，这些转录物参与TNF信号传导，其上调可以促进细胞凋亡。此外，YTHDF2被发现在肺癌中上调，并异常地促进6PGD mRNA的翻译，而6PGD mRNA是促进肿瘤生长的关键。然而，YTHDF2也能够通过促进HCC细胞中EGFR mRNA的降解来抑制细胞增殖、肿瘤生长以及MEK和ERK信号的激活。
(4)靶向癌症中的m6A机制
考虑到m6A调控蛋白在几种癌症标志中的关键作用，它们是很有希望的治疗靶点，特别是Writers和Erasers，因为它们的活性可以被小分子调控。虽然目前还没有RNA甲基转移酶的小分子抑制剂，但通过生化或细胞小分子化合物库筛选或化学合成，已经发现或开发了几种脱甲基酶抑制剂，其中最常见的是抑制剂以FTO为靶点。
在一项开创性的研究中，Su R等人发现FTO被肿瘤代谢物R-2-羟基戊二酸（R-2HG）所抑制，用R-2HG直接抑制AML和胶质瘤细胞的FTO，使c-MYC和CEBPA mRNA的甲基化增加，表达减少，阻断了AML和胶质瘤细胞的增殖、细胞周期和诱导细胞凋亡。此后，鉴于在临床前水平上取得了可喜的结果，其他研究试图开发针对FTO或AKLBH5 RNA脱甲基酶的小分子抑制剂。例如，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的非甾体抗炎药--甲氯芬酸（Meclofenamic acid，MA）MA2的乙酯形式被发现是一种FTO抑制剂，可使胶质母细胞瘤细胞中mRNA的m6A修饰水平升高，抑制肿瘤进展，延长GSC移植小鼠的寿命。
此外，根据FTO和ALKBH5域的结构，其他小组还设计了2-氧代戊二酸和铁依赖性氧合酶（2OGX）抑制剂来靶向m6A Erasers，例如IOX3抑制剂。然而，有希望的抑制剂有一定的局限性，需要在临床使用前加以考虑，如所有的2-氧代戊二酸衍生物都不是选择性的，也可能会抑制其他Fe (II)和2OG依赖性氧酶的活性。最近的研究开发了两种FTO抑制剂，即FB23和FB23-2，它们在体外可抑制AML细胞增殖，促进AML细胞分化/凋亡，在异种移植小鼠中可显著抑制人AML的进展。
尽管对某些类型的肿瘤的结果相互矛盾，但m6A调节剂在几种癌症标志中显示出广泛的意义。然而，有争议的结果反映出，m6A异常沉积的后果可能取决于癌症或细胞类型背景、其他信号通路的失调和不同的底物集。因此，未来的研究将准确地确定每个单独的m6A调节器在不同类型的癌症中的生物学功能，他们将确定每个关键的目标转录物，揭示确切的潜在机制。此外，开发选择性和临床有效的m6A调节酶抑制剂可能会提供有效的治疗策略，单独或与其他治疗药物联合使用。例如，新抗原特异性免疫被证明是通过YTHDF1以m6A依赖的方式进行调节。从机制上看，编码溶酶体蛋白酶的转录本被m6A标记并被YTHDF1结合，从而导致溶酶体cathepsins的翻译增加和树突状细胞的交叉呈现减少，这意味着YTHDF1和m6A是抗癌免疫疗法的潜在治疗靶点。
(二)5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)
(1)m5C在RNA中的沉积
m5C是所有生命领域RNA中一个保守和普遍的标记。m5C存在于广泛的RNA中，但在真核生物的tRNA和rRNA中含量最丰富。目前全球的m5C检测方法依赖于在亚硫酸氢钠存在的情况下细胞嘧啶的化学反应性，或者使用针对m5C的抗体或先前与RNA靶标交联的RNA甲基转移酶的免疫沉淀方法。RNA亚硫酸氢盐测序是绘制m5C最常用的技术，同时它也有效地检测了丰富的RNA如tRNA和rRNA中的m5C。最近的研究使用改进的亚硫酸氢盐测序方法和新的计算方法仅报道了人类和小鼠转录组中几百个m5C位点。目前尚不确定的是，这种低患病率是否具有生物学价值，需要进一步调查。
i)m5C Writer
在人类中，5-胞嘧啶甲基化是由NOL1/NOP2/sun(Nsun)家族、DNMT2和TRDMT1催化的。DNMT2、NSUN2、NSUN3和NSUN6都能使细胞质tRNA甲基化，然而其特异性和残基不同。例如，NSUN2在可变环上甲基化绝大部分tRNA，并在摆动位上甲基化亮氨酸，而NSUN6靶向少数tRNA的受体茎。NSUN2也甲基化mRNA、ncRNAs和lncRNAS。NSUN3靶向线粒体中的tRNA，其沉积是形成5-甲酰基胞嘧啶(f5m)的必要条件。NOP2 (NSUN1)和NSUN5是28S rRNA中核仁性和甲基性非常保守的残基，靠近肽基转移酶中心，分别靠近肽基转移酶中心和在大亚基和小亚基之间的界面。最后，NSUN4靶向线粒体rRNA的小亚基。
ii)m5C Eraser
虽然m5C的writer现在有了很好的记录，但m5C的 Eraser仍存在争议。一些报道表明m5C可以氧化生成5-hydroxy methylcytosine (hm5C)一千零一十一转运蛋白家族的酶(春节)mRNA(图3 (Fig.3a))(177、178)和形成f5C Alpha-Ketoglutarate-Dependent加双氧酶AlkB同族体1 (ALKBH1)线粒体的摆动位置图示(图(Fig.3b) 3 b)(160、163、166)。虽然f5C沉积在线粒体tRNAs中的生物学意义已经得到很好的证实[160,163,166]，但低含量hm5C沉积在mrna中的生物学意义仍有待确定。
但有报道指出，m5C可以被mRNA中的TET氧化生成5-羟甲基胞嘧啶（hm5C），并被线粒体tRNA的摆动位置的ALKBH1形成f5C。虽然线粒体tRNA中f5C沉积的生物学相关性已被证实，但mRNA中低丰度的hm5C沉积的生物学相关性仍有待确定。
(2)m5C在RNA中沉积的分子功能
i)m5C在非编码RNA中的作用
tRNAs中m5C丢失的功能后果已经得到了很好的研究。DNMT2和NSUN2沉积m5C保护tRNAs免受血管生成素的内核分解。NSUN2介导的m5C在tRNA中的沉积调节了组织和癌症干细胞的分化和应激反应。从分子上看，tRNA的5-胞嘧啶甲基化保护它们不被血管生成素加工成tRNA衍生的小RNA片段（tRFs）。tRFs的形成通常是在应激下诱导的，可以抑制规范翻译，并有利于核糖体在应激反应转录本5’UTR中的非常规5’起始位点组装。
相反，DNMT2介导的tRNA在C38处甲基化的缺失会导致tRNA裂解，从而导致特异性密码子误译。同样，在酵母、苍蝇、蠕虫和小鼠中，rRNA 5-胞嘧啶甲基转移酶的缺失并不致命，然而，在所有情况下，m5C的沉积水平在调节细胞对应激包括药物、DNA损伤、氧化应激或环境线索的反应中起着重要作用。从机制上讲，rRNA修饰如NSUN5介导的甲基化可微调核糖体的翻译能力，使其适应特异性翻译与应激相关的mRNA。在小的ncRNA和lncRNA中也检测到m5C，m5C沉积在vtRNA等ncRNA上，也会影响其加工成类似miRNA的调节性小RNA。
ii)m5C在mRNA中的作用
最近有两项研究报道发现了与m5C修饰的mrna结合的Reader，揭示了m5C沉积在mrna中的生物学相关性和作用。在一篇报道中，任何核苷酸位置的核成熟甲基化mrna都与核输出因子AlyREF相互作用，更有可能输出到细胞质中。另一报道显示，在癌细胞中NSUN2在3′UTR处的致癌mRNA异常甲基化，增加了其与Reader蛋白YBX1的相互作用，YBX1通过招募ELAVL1维持其靶向mRNA的稳定性。尽管有这些研究，但寻找m5C在mRNA上的流行率、沉积位点偏好、分子功能、Writers和Readers等方面的进展仍不明确。
(3)m5C在癌症中的作用
i)m5C Writer在癌症中的作用
在过去的十年中，已经发现一些5-胞嘧啶甲基转移酶与各种人类疾病包括几种癌症类型有关（表2）。NOP2过表达早已被证明可以增加小鼠成纤维细胞的增殖，并且发现它是一种有价值的增殖标志物。已发现NOP2的表达在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胆囊癌中上调，其表达与不良预后相关。从机制上看，NOP2已被证实与TCF结合元件结合，招募TERC元件，激活环蛋白D1转录。NOP2对rRNA的甲基化活性是否参与其中未探讨。
NSUN2表达改变与多种癌症类型有关，包括乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌、胆囊癌、胃癌和头颈部鳞癌。DNMT2在数百种肿瘤样本中上调，并且在不同类型的肿瘤中发现了DNMT2的多个体细胞突变。NSUN4位点与增加乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌的风险相关，其高表达与肝癌相关。最后，NSUN5的表达已被发现与胶质母细胞瘤的低生存期相关，NSUN7的高表达与低级别胶质瘤的短生存期相关。
关于相关机制，甲基酶的分子作用似乎取决于组织和环境，对每种癌症类型表现出不同的独特底物偏好，但具有统一的致癌结果。例如，对于NSUN2的过度表达被证明可以调节肿瘤抑制基因或抑癌基因的转录本，从而促进增殖。最近也有研究表明NSUN2在食管癌中通过NMR ncRNA的甲基化促进肿瘤的进展。最近的另一项研究报道，NSUN2介导的致癌mRNA，如HDGF的3′UTR处的异常甲基化可以通过与YBX1相互作用增加其稳定性。虽然这些报道都集中在m5C发生率较低的mRNA或其他转录物的命运上，考虑到tRNA是NSUN2的主要靶点，且在C-5处高度甲基化，但NSUN2在癌症中的潜在作用是否真的可能是由mRNA的修饰所介导，目前尚不清楚。
关于tRNA甲基化功能，有报道显示NSUN2在皮肤肿瘤的增殖祖细胞群中被上调，而这些细胞依赖于m5C在tRNA上的正确沉积。出乎意料的是，小鼠细胞和小鼠癌细胞中NSun2的缺失导致tRNA的低甲基化，显示出更容易受到核糖核酸酶血管生成素的影响，从而导致5 ' -tRNA片段的积累。越来越多的人认识到，tRNA片段的生物发生主要是在应激条件下诱导的，它们的异常表达常见于癌症，可能表明其在肿瘤发生中具有重要的调控功能。
研究表明，5′-tRNA片段可以通过调节翻译起始因子与翻译起始复合物的结合，重新编程翻译以有利于应激反应，如在Nsun2缺失的小鼠癌细胞中，与应激反应途径相关的基因翻译增加，而与分化相关的基因翻译减少。重要的是，数据显示，Nsun2缺失的细胞将其阻断在未分化和更多的增殖状态，这是组织或肿瘤干细胞自我更新所必需的。然而，长期的Nsun2缺乏显示增加了未分化细胞对压力的敏感性，使用5 ' FU或顺铂等化疗药物能更有效地杀死Nsun2缺陷的皮肤肿瘤起始细胞，在使用血管生素抑制剂治疗后，这些药物可以进一步挽救。虽然5′-tRNA片段直接有利于特定转录集翻译的确切机制尚不清楚，但该研究表明，联合使用tRNA片段生物发生增强剂（如NSUN2抑制剂）与对流化疗药物，可以形成一种特异性消灭肿瘤起始细胞的高效策略。
因此，这些研究和其他研究表明，肿瘤起始细胞和癌细胞需要严格控制tRNA甲基化、tRNA片段生物发生和蛋白质合成，以准确地控制细胞反应和维持肿瘤的体积，并建议将tRNA甲基化抑制剂作为细胞毒应激的强效癌症起始细胞敏化剂。
研究发现，小鼠和果蝇的Dnmt2缺失表现为应激反应和分化缺陷，这进一步支持了tRNA修饰在生存和分化中的作用。与Nsun2 -/-小鼠表型一致，小鼠的Dnmt2缺失不会整体扰乱蛋白质合成速率，而是通过tRNA甲基化缺失导致的翻译保真度降低而影响特定mRNA。然而Dnmt2丢失或5-胞嘧啶甲基化抑制导致的tRNA裂解升高的潜在生物学影响仍完全没有被探讨。要揭示tRNA片段丰度对所观察到的复杂表型的贡献，还需要更多的工作。
rRNA甲基化的改变也与癌症有关。NSUN5 mRNA的表达与胶质母细胞瘤患者的不良生存密切相关。胶质瘤中NSUN5表达的表观遗传学损失导致rRNA胞嘧啶低甲基化和生存因子翻译增加，使胶质瘤细胞对应激相关酶NQO1的底物敏感。
因此，这些发现表明了tRNA和rRNA甲基化的严格控制和专门的蛋白质合成方案的重要性，并为寻找tRNA甲基化酶抑制剂作为治疗癌症的有效新方法奠定了基础。
ii)m5C Eraser在癌症中的作用
m5C Eraser在癌症中也被发现发生了改变，TET和ALKBH1的突变或表达改变与一些恶性肿瘤有很大关系。例如，TET2和ALKBH1突变与淋巴细胞性和骨髓性白血病有关。TET1的表达在胶质母细胞瘤中上调，TET2在胶质瘤中下调，TET3在胶质瘤中被表观遗传抑制。虽然从机理上看，其原因总是与DNA脱甲基化或羟甲基化缺陷有关，但TET和ALKBH1也被证明可以氧化RNA中的m5C，这就提出了RNA羟甲基化缺陷是否也会与癌症有关的问题。
(4)靶向癌症中的m5C机制
到目前为止，还没有开发出特异性的5-胞嘧啶甲基转移酶抑制剂。然而，考虑到一些旨在干扰DNA5-胞嘧啶甲基化的药物依赖于胞嘧啶的化学类似物，它们可能会很好地干扰RNA甲基化。事实上，在一项研究中，用氮杂胞苷完全抑制癌细胞中Dmnt2介导的5-胞嘧啶tRNA甲基化在癌细胞中降低了它们的增殖能力，支持了减少5-胞嘧啶甲基化的tRNA可能是一种有效的癌症治疗策略的观点。尽管取得了可喜的结果和潜在的临床意义，但这些类似物既能抑制RNA又能抑制DNA甲基转移酶的事实提高了人们对这种非选择性药物使用的认识，它可能会影响多个靶点（DNA、tRNA、rRNA、mRNA、ncRNA）的甲基化，并可能产生破坏性后果。
与抑制tRNA甲基化酶可能导致化疗耐药的观点一致，沉默其他tRNA甲基转移酶，如METTL1也能在多个tRNA的可变环上甲基化tRNA。
(三)假尿苷（Pseudouridine,Ψ）
(1)假尿苷在RNA中的沉淀作用
假尿苷（Ψ）是尿苷的五碳糖苷异构体，是最早发现的转录后修饰，也是RNA最丰富的修饰之一，但发现它的生物学功能才刚刚开始。
假尿苷最初是在酵母的tRNA和rRNA上检测到的，现在我们知道不同类型的RNA，包括tRNA、rRNA、snRNA、scaRNA、miRNA、lncRNA也都是假尿苷修饰的。
i)假尿苷合成酶
假尿苷修饰可以通过两种不同的机制实现，即RNA依赖性和RNA依赖性的假尿苷化。RNA依赖性机制依赖于H/ACA snoRNPs的RNA-蛋白复合物（DKC1、Nhp2、Nop10和Gar1）。在H/ACA中，ncRNA通过与RNA底物的互补碱基配对相互作用负责底物识别，DKC1提供催化活性。RNA独立的假尿苷化是由单一的酶--假尿苷合成酶(PUS)催化的，该酶在没有RNA模板链的情况下同时进行底物识别和催化。RNA独立的假尿苷合成酶对RNA底物识别的规则仅在少数情况下被阐明，如假尿苷合成酶具有相当严格的底物特异性，只能修饰细胞RNA中的一种位置（如tRNAs）。严格的底物特异性取决于大多数tRNA中普遍保守的G53UUCNANNC60序列，以及TΨC环的三维结构。通过分析原核生物酶TruB与分离的tRNA茎环的共晶体结构也发现了类似的结果。这些晶体说明了酶核心域如何与RNA进行广泛的相互作用，以及TruB如何需要TΨC环周围的共识序列。而具有较宽底物谱的酶的作用机制是不同的。例如，PUS1它能使tRNA中的三个位置甲基化，依靠蛋白质表面的两个带正电荷的RNA结合裂隙与tRNA的相互作用。对于PUS7来说，识别基底需要序列和二维结构。其他具有更广泛底物库的假尿苷合成酶如何能以高度的特异性识别所有不同的底物，目前仍在研究中。
在真核生物中，有超过十四种不同的PUS酶，其中有十种酶属于PUS家族，包括PUS1-10，它们每一种酶都有特定的底物，但也有一些底物是共享的。例如，PUS1修饰38、39和/或40位的tRNA，而PUS4和PUS10修饰55位的tRNAs。关于Eraser，假尿苷化和碱基甲基化之间的一个重要区别是假尿苷化在哺乳动物中是一种不可逆的修饰。但迄今为止，还没有Reader的相关描述。
(2)假尿苷在RNA中沉积的分子功能
假尿苷修饰根据被修饰的RNA发挥不同的生理作用，但最常见的实验数据证实在基因表达调控的不同方面发挥着重要作用。假尿苷的存在能够增加RNA的磷酸二酯骨架的刚性，影响其热力学稳定性和空间构象，使短RNA更加稳定。在snRNA中，体外假尿苷修饰产生RNA构象变化，影响snRNA与mRNA的相互作用。体内研究表明，这些构象变化对snRNA的活性很重要。例如，酵母U2 snRNA在应激过程中，在U56和U93位置被RNA独立酶PUS7和H/ACA RNP复合物(snR81) 的假尿苷修饰，对前mRNA的剪接效率有功能影响。
假尿苷修饰也对不同类型的RNA（如rRNAs）产生结构稳定性。在rRNAs中，假尿苷存在于解码位点、mRNA通道、肽基转移酶中心、tRNA结合位点和核糖体亚单位界面，从而显示出对核糖体的正确组装和功能以及蛋白质合成的重要作用。例如在酵母中，Cbf5p的假尿苷合成酶域中氨基酸的改变或置换会废除rRNA的假尿苷修饰，导致生长缺陷和rRNA的胞质40S和60S亚基水平降低。在小鼠胚胎成纤维细胞中，DKC1突变体的表达导致rRNA加工改变，rRNA的二级结构不稳定，细胞生长缺陷。另一个类似的例子发生在引导rRNA修饰的H/ACA snoRNAs丢失或破坏后，在酵母rRNA中U2919位置的假尿苷化是由5个H/ACA snoRNAs引导的，它们的丢失会导致U2919位置的rRNA假尿苷化减少，酵母中18S rRNA生物发生和生长缺陷受损。
在mRNA中，假尿苷的加入可以介导无义密码子到有义密码子的转换，促进核糖体解码中心的碱基配对，从而导致蛋白质的多样性。其他体外研究也报道，与未修饰的mRNA相比，含有假尿苷的mRNA翻译速度减慢，mRNA解码受到影响。此外，含假尿苷的mRNA在承受应激的细胞中表现出较高的稳定性，说明假尿苷的增加会增加其稳定性。事实上，引入哺乳动物细胞或小鼠组织中的含假尿苷的体外转录mRNA相对于含尿苷的体外转录mRNA显示出更高的稳定性。值得注意的是，mRNA中的大部分假尿苷是在对环境信号的反应中进行调控的，但其功能作用仍不甚明了。
在tRNA中，假尿苷修饰存在于反密码子干和环、假尿苷环、55位的保守中，这些都能稳定其三级结构，对密码子-反密码子碱基配对很重要。最近利用人类胚胎干细胞(hESCs)和造血干细胞和祖细胞(HSPCs)获得了对tRNA假尿苷化作用的新见解，该工作揭示了与m5C在反密码子和可变环上的沉积类似，PUS7在tRNA第八位的假尿苷沉积调控了一类特定的含有5′末端寡鸟嘌呤基团（mTOGs）的18nt 5′tRNA片段的生物生成。此外，该研究还表明，该类新型小ncRNA的8位存在假尿苷是高效地与5′帽翻译起始复合物的一个组成部分聚腺苷酸结合蛋白1（PABPC1）结合的必要条件，从而使PABPC1从帽mRNAS中移位并重新编程翻译。因此，该研究表明，通过调节一类新型ncrna的生物发生，RNA修饰可以使翻译机制专门化。
假尿苷对其他RNA的作用仍不太清楚。例如，TERC也是假尿苷化的，在这里已经检测到两个特定的假尿苷化位点，不过目前还没有证据表明这种修饰可能参与端粒酶的活性。在miRNA中，PUS10的耗竭会导致成熟miRNA的表达水平明显降低，同时未加工的pri-miRNA也会随之积累，但出乎意料的是，这一过程的结果与PUS10的催化活性无关。
总之，假尿苷的沉积可能赋予修饰后的RNA不同的分子特性，从而改变其命运或活性。虽然最近的研究大多集中在mRNA的Ψ修饰上，但其对mRNA的作用目前仍不清楚。因此，要完全了解假尿苷对mRNA的分子作用，还需要进一步的研究。假尿苷在其他类型的RNA上，如snRNA、rRNA或tRNA上的含量非常丰富，其作用已被研究多年。然而，最近的研究结果仍在揭示一些新的、意想不到的功能，如假尿苷在tRNA片段上的作用，从而表明其他功能还有待发现。
(3)假尿苷RNA修饰在癌症中的作用
i)DKC1在癌症中的作用
与假尿苷修饰缺陷有关的研究最多的疾病之一是X连锁先天性角化不良（X-DC），与DKC1失活突变有关。DKC1主要修饰rRNAs和snRNAs，它还参与活性端粒酶复合物。X-DC以网状皮肤色素缺失、甲营养不良和粘膜白斑病为特征，但骨髓衰竭是X-DC患者早期死亡的主要原因，其患者还具有较高的癌症发病风险，表达改变也与癌症相关。已发现DKC1的改变与皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胶质瘤、肝癌有关，特别是骨髓衰竭综合征和血液系统恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病或多发性骨髓瘤（表3）。
从分子的角度，DKC1中核仁的蛋白质参与端粒酶RNA组件的稳定，是端粒酶活性所必需的，以及重要核糖体域的多种rRNA残基的假尿苷修饰用于tRNA和mRNA的结合，这些都是高度增殖细胞的重要功能。因此，缺乏DKC1活性会通过端粒酶活性的损害和特定mRNA的核糖体翻译受阻，主要影响细胞快速更替的组织，导致复制潜能降低和早衰。从机理上看，已经有研究表明，低水平的假尿苷修饰rRNA下调了p53、p27和细胞凋亡抑制剂(Bcl-xL、XIAP)等肿瘤抑制物的内核糖体进入(IRES)依赖性翻译。血管内皮生长因子的表达增加与DKC1的丢失有关，导致它们的耗竭在癌症发展的高发期。
最近其他调查rRNA中假尿苷的作用的研究也支持了癌症中存在专门核糖体的新假说。在肝癌细胞中，snoRNA24的异常表达，介导18S rRNA中U609和U863位置的假尿苷修饰，导致tRNA选择效率、核糖体伸长率和翻译效率上的变化，影响癌细胞的生存。另一个rRNA假尿苷修饰的例子是在结直肠癌中发现rRNA的m1acp3假尿苷修饰减少，影响tRNA与核糖体P位点的直接相互作用，改变和解除对癌细胞翻译的调控。
虽然有更多的证据表明DKC1作为肿瘤抑制物，但与此相反，其他研究表明其具有致癌作用。例如，在乳腺癌中，DKC1表达水平、rRNA假尿苷修饰和端粒长度的降低与更好的预后相关。在胶质瘤中，DKC1的表达增加和假尿苷修饰通过诱导胶质瘤发生调节因子的上调表达促进胶质瘤细胞的生长和迁移，但RNA的假尿苷修饰增加和胶质瘤发生的直接作用仍未探讨。
到目前为止的数据显示，DKC1表达或活性的改变与癌症显著相关，然而确切的机制可能是细胞、组织或DKC1底物依赖性，但需要进一步的研究来充分探讨DKC1是否具有促癌或抑瘤作用。
ii)RNA非依赖性假尿苷合成酶在癌症中的作用
尽管DKC1活性或表达改变与癌症有显著关联，但对其他假尿苷酶的作用知之甚少，只有少数研究将其表达或活性的改变与癌症相关联（表3）。例如，PUS1介导SRA1与RARγ的相互作用，以及与乳腺癌细胞系中的雌激素受体的相互作用。PUS10是TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导前列腺癌细胞凋亡的介导因子，PUS10位点的基因组改变与肺癌风险显著相关，但这种影响是否依赖于假尿苷酶活性尚不清楚。PUS7缺失经常发生在骨髓增生异常综合征、以造血干细胞功能障碍和向AML转化的高风险为特征的血友病克隆疾病中。研究表明，在hESC和HSPCs中，PUS7缺失降低了PUS7介导的一类特殊的tRNA衍生RNA片段的假尿苷修饰，诱导蛋白质合成率显著提高，导致显著的生长和分化缺陷。因此，这项工作支持了ESC和癌细胞对蛋白质合成的扰动高度敏感的新观点，并强调了tRNA片段在重新编程翻译中的重要作用。但仍需要更多的研究工作以探索针对癌症中PUS7丢失或异常tRNA片段生物生成的临床意义。
(4)以癌症中的假尿苷合成酶为靶点
从临床的角度来看，PUSs或假尿苷可以作为潜在的抗癌靶点和生物标志物。例如，在结肠癌、前列腺癌、卵巢癌患者的尿液中、卵巢患者的血浆中以及口腔鳞状细胞癌患者的唾液代谢物中均可检测到大量的假尿苷，提示其可作为液体无创活检中潜在的生物标志物，用于早期癌症诊断。然而，尽管DKC1的突变和表达改变在癌症中已被大量报道，但对于其他假尿苷合成酶的情况却鲜有报道。随着癌症基因组和全转录组研究的到来，未来的计算分析将揭示所有已知的人类假尿苷合成酶的突变和表达状态。
在药物设计或筛选抑制PUSs活性的小分子方面，虽然有几项研究试图生成或发现降低DKC1活性的化合物作为潜在的抗癌治疗手段，但进展甚微。临床试验进行卵巢癌，肉瘤，结直肠癌，急性骨髓性白血病，乳腺癌，肺癌，黑色素瘤和其他癌症以检查吡唑呋林（一种也抑制DKC1的ODCase小分子抑制剂）作为抗癌治疗的效果，但在所有情况下吡唑呋林都未能表现出高效的抗癌活性。然而，由于没有考虑DKC1的表达水平，因此，吡唑呋林是否可以作为一种有效的治疗方法，从这些研究中无法得出结论。
5’fu是另一种潜在的小分子抑制剂，目前已被临床用作有效的抗癌药物，可以提高各种癌症的生存率。虽然5’fu活性代谢产物的作用机制一直被认为是破坏DNA和RNA的合成和DNA损伤诱导，但5'FU被证明可以抑制假尿嘧啶合成酶，这是因为RNA中的类似物5'FU取代了尿嘧啶。研究中表明，含氟tRNA与酵母假尿苷合成酶产生特异性和稳定的非共价复合物，从而起到强效和不可逆的抑制作用。尽管如此，5'FU并不是所有假尿苷合酶的通用抑制剂，TruB大肠杆菌以及大多数其真核同源物，都不能与氟化RNA形成共价加合物。因此，检测5’fu对哺乳动物假尿苷合成酶的特异性和有效性将是一项很有意义的工作。此外，确定5'FU的相关细胞毒性是否部分是由于RNA假尿苷化的整体减少或特定修饰的RNA（如rRNA）的损失也是很重要的。
最近的研究使用了可以预测可能的新抑制剂的方法。在一项研究预测了基于DKC1与TERC相互作用的破坏的小分子抑制剂的使用，基于虚拟对接的筛选发现了10个具有高亲和力的分子，其中3个在乳腺癌细胞系中产生了强大的端粒酶抑制剂。在另一项研究中推测核苷类化合物，如异恶唑啉基衍生物5′-单磷酸可以作为假尿苷5′-单磷酸糖苷酶的抑制剂，与天然底物竞争，阻碍糖苷C-C键的裂解。他们确实发现异恶唑烷基衍生物在酶的活性位点上比天然底物具有更高的配体效率，导致了体外酶抑制。虽然我们仍然忽略了肿瘤生长抑制电位和使用首批抑制剂的治疗益处，但这些研究为继续寻找用于癌症治疗的假尿苷合成酶抑制剂奠定了基础。
RNA修饰已成为基因表达程序的关键转录后调节器。我们开始认识到表观转录组与新陈代谢、表观遗传学、染色质重塑、免疫系统等相互作用的功能网络，认识到RNA修饰异常沉积在包括癌症在内的人类疾病中所带来的广泛功能后果。在快速发展的转录组学领域中的最新进展已将转录组学组件的重新编程与癌症联系在一起，而构成表观转录组的大量RNA修饰和表观转录组畸变的可逆性质，为表观转录组治疗领域的出现提供了希望。在特定的细胞背景，细胞类型，细胞增殖能力或肿瘤微环境中，鉴定准确的转录组生物标志物并确定给定异常修饰的致癌或肿瘤抑制作用将指导寻找确切的分子靶标，以开发针对给定肿瘤类或其他复杂疾病的有效疗法和具有药物价值的新型药物。
更多精彩文章 生信人
更多个性化生信分析生信意向表单
参考文章：Nombela P, Miguel-López B, Blanco S. The role of m6A, m5C and Ψ RNA modifications in cancer: Novel therapeutic opportunities. Mol Cancer. 2021 Jan 18;20(1):18. doi: 10.1186/s12943-020-01263-w. PMID: 33461542.
网友评论