GENEWISE 的使用

今天要用到genewise 软件分析数据，记录一下过程！

1. GeneWise 简介

Genewise主要用于将蛋白质序列和DNA序列进行比对，从而对DNA序列上的编码区进行预测。这是一个非常老的软件，距离他不更新至少有10多年了，但是目前还是有很多公司用他进行基因组注释，包括ENSEMBL的注释流程的几个核心部分用到的也是它。

2. GeneWise 安装

 wget http://www.ebi.ac.uk/~birney/wise2/wise2.4.1.tar.gz
 tar zxf wise2.4.1.tar.gz -C /opt/biosoft/
 cd /opt/biosoft/src
find . -name  makefile | xargs sed -i 's/glib-config/pkg-config glib-2.0/'   ＃将src目录下所有makefile中的glib-config替换成glib-2.0

perl -p -i -e 's/getline/getline_ReadSeqVars/g' ./HMMer2/sqio.c   ＃替换genewise使用库中函数名发生改变的部分，例如getline,现在是getline_ReadSeqVar
perl -p -i -e 's/isnumber/isdigit/' models/phasemodel.c

perl -p -i -e's/csh welcome.csh/sh welcome.csh/'  makefile 　　#将csh改成sh

sed -i 's/-ldyna_glib/-ldyna_glib `pkg-config --libs glib-2.0`/' models/makefile　　　＃解决编译过程中g_hash_table_foreach_remove的bug, 似乎在Linux平台不存在这个问题

make all     ＃最后编译加测试
export WISECONFIGDIR=~/home/yt/biotools/wise2.4.1/wisecfg
make test

echo 'PATH=$PATH:~/home/yt/biotools/wise2.4.1/src/bin/' >> ~/.bashrc    ＃修改环境变量
echo 'export WISECONFIGDIR=~/home/yt/biotools/wise2.4.1/wisecfg/' >> ~/.bashrc 
source ~/.bashrc

3. GeneWise的使用

在GeneWise的安装目录下，有一个wise2.tex文件，阐述了详细的genewise的使用方法。其软件最常用的命令是genewise。该命令的常用示例：

genewise protein.fasta dna.fasta -both -gff
＃程序输入的蛋白质序列和DNA序列分别是2个fasta文件。这两个fasta文件中仅有第一条序列是有效的，genewise仅对其中的2个第一条序列进行比对。以上示例对dna序列的正负链都进行cds预测，并将gff格式结果文件输出到标准输出。

genewise的常用参数：

-trev           ＃仅对负义链进行cds预测
-tfor           ＃仅对正义链进行cds预测，该参数是默认值
-both　　        ＃对负链都进行cds预测
-genes          ＃给出gene结构的结果，非常简单的exon信息结果。默认情况下仅输出适合人类阅读的比对结果
-gff            ＃给出gff格式的结果
-cdna　　        ＃给出cdna序列
-pep            ＃给出cds翻译出的蛋白质序列
-splice [model/flat]  ＃使用的split site是model（默认值）或GT/AG。
-help           ＃给出帮助信息。
-version        ＃给出版本信息。
-silent         ＃标准错误输出不输出messages信息。
-quiet          ＃标准错误输出不输出report/info信息。

GeneWise的高级使用

注意，-options的顺序并不重要，但是蛋白质文件必须是dna文件之前

基因序列与蛋白质比较 genewise：

genewise protein.pep cosmid.dna　　       比较蛋白质序列与DNA序列
genewise -hmmer pkinase.hmm cosmid.dna    比较了蛋白质谱HMM与DNA序列
genewisedb protein.pep human.fa           将单个蛋白质序列与DNA序列数据库比较
genewisedb -hmmer pkinase.hmm human.fa    将单个蛋白质谱HMM与DNA序列数据库
genewisedb -prodb protein.pep -dnas cosmid.dna    比较蛋白质数据库序列到单个dna序列
genewisedb -pfam Pfam -dnas cosmid.dna            比较了蛋白质谱HMM的数据库到单个dna序列
genewisedb -prodb protein.pep human.fa            比较蛋白质数据库序列到dna数据库序列-请注意，这将需要一段时间！
genewisedb -pfam Pfam human.fa                    比较了蛋白质谱HMM的数据库到单个序列的数据库-请注意，这将需要一段时间！

estwise（蛋白质与est / cDNA比较）具有完全相同的运行模式。

estwise protein.pep singleest.fa           将蛋白质序列与DNA序列进行比较（相同如上面的示例）
estwise -hmmer pkinase.hmm singleest.fa    将HMM与DNA序列进行比较
estwisedb protein.pep est.fa               将单个蛋白质序列与DNA序列数据库
estwisedb -hmmer pkinase.hmm est.fa        将单个蛋白质配置文件HMM与DNA序列数据库
estwisedb -prodb protein.pep -dnas singleest.fa   比较蛋白质数据库序列到单个dna序列
estwisedb -pfam Pfam -dnas singleest.fa        比较了蛋白质谱HMM的数据库到单个dna序列
estwisedb -prodb protein.pep est.fa            比较蛋白质数据库序列到dna数据库序列-请注意，这将需要一段时间！
estwisedb -pfam Pfam est.fa                    比较了蛋白质谱HMM的数据库到单个序列的数据库-请注意，这将需要一段时间

示例：

蛋白质数据库与基因组数据库比较，输出格式为 gff 格式，输出文件名为genewise.out

genewisedb -prodb  protein.fasta bed_FASTA.fasta -gff > genewise.out

4.genewise的运行原理简述：

1. genewise的算法：21:93算法是genewise的基础算法。该算法简单讲就是 Match-Insert-Delete，在蛋白质序列和DNA序列比对后能准确划定intron边界。算法将intron分成5部分：5'端splice site、中间intron主体、富含CT区域、连接区、3'端splice site。根据蛋白质序列和DNA序列的比对结果算出Intron部分，从而将DNA序列的CDS区分成了Match、Insert和Delete 3部分，再对这3部分进行蛋白质翻译或移码翻译，从而划定intron边界，得到CDS信息。
2. 6:23算法则是2:93算法的简单版本，也是软件的默认设置。和2:93算法相比，6:23算法的intron没有第3和第4部分（富含CT区域、连接区）。同时，6:23算法更适合于DNA序列中没有屏蔽重复或introns序列比较怪异的情况。使用该算法的时候，-intron参数的值得tied（也是该参数默认的值），否则会得到错误的很长的intron结果。
3. 若是算法后面带个 L 字样，则表示适用于进行输入的蛋白质序列是 HMM 模型。此外， 还有其它的一些算法，可以参考wise2.pdf文件。
4. genewise对基因进行预测后，有一个得分。该得分 = log2(预测模型的可能性/随机结果的可能性) 。因此，0表示该结果是个随机的结果，不可靠的。根据软件作者的经验，得分高于35的结果是非常可靠的；得分25-35的结果是可信的；得分18-25的结果可能仅适用于某些蛋白质家族；得分低于15的是不可信的。

用临近物种的protein序列对基因组进行homolog gene预测的时候，需要通过blast将proteins序列和基因组序列进行比对，再提取基因组的目标基因区域和最佳结果protein进行genewise分析。因此，需要自己写一些程序进行并行化的genewise计算，从而达到对全基因组大数据的分析。Genewise软件提供了一支程序/opt/biosoft/wise2.4.1/src/perl/scripts/blastwise.pl，程序能进行该项处理（我没有用过该程序，我自己写用python写代码，并借助bedtools得到目标序列）。

示例：单个蛋白质序列跟单个基因比较

genewise jason.pep jason.dna  
#显示结果
Name: wise2-4-1 $ (unreleased release)
This program is freely distributed under a GPL. See source directory
Copyright (c) GRL limited: portions of the code are from separate copyright

Query protein:       BRR2
Comp Matrix:         /usr/share/wise/BLOSUM62.bla
Gap open:            12
Gap extension:       2
Start/End            default
Target Sequence      Contig4084
Strand:              forward
Start/End (protein)  default
Gene Parameter file: /usr/share/wise/gene.stat
Splice site model:   GT/AG only
GT/AG bits penalty   -9.96
Codon Table:         /usr/share/wise/codon.table
Subs error:          1e-06
Indel error:         1e-06
Null model           syn
Algorithm            623
Find start end points: [964,36][2175,3876] Score 454309
Recovering alignment: Alignment recoveredplicit read offffone 74%%

genewise output
Score 1310.86 bits over entire alignment
Scores as bits over a synchronous coding model

Warning: The bits scores is not probablistically correct for single seqs
See WWW help for more info

BRR2             965 YVRMLRSPALYSVGPEYDD-DKYLVQKR                      
                     YVRML SP LY+VG +Y + D  LVQKR                      
                     YVRMLESPKLYNVGADYQEGDDALVQKR                      
Contig4084        35 tgcatgtcactaggggtcgggggcgcac                      
                     atgttaccataatgcaaaagaacttaag                      
                     tgagggtcggctgcaccggctcgctgga                      


BRR2             992                               DLLHSAAILLEKCKLLVYN 
                                                   DL+HSAA+LLEK  L+ Y+ 
                               A:A[gcc]            DLIHSAAVLLEKGGLVRYD 
Contig4084       119 GGTGAGTA  Intron 1       CAGCCgcactgggccgaggcgctg 
                      <1-----[120    :    169]-1>  attaccctttaaggttgaa 
                                                   tgctcttctcagatctctc 


BRR2            1012 RQSGTLTATELGKVAASYYVTHNSMAIYNRLLMQTTSFIELFRVFSFSD 
                     R +G   +T+LG++A+ YY+ ++SM++YN+ L    ++I+LFRVF++S+ 
                     RATGVFQSTDLGRIASHYYIAYSSMSVYNKHLKPNMTMIDLFRVFALSN 
Contig4084       229 cgaggtctagcgcagtcttagtttatgtaaccacaaaaagctcgtgtaa 
                     gccgttaccatggtccaaatcacctctaaaatacatcttattgttctga 
                     ttttccgtcctcttcgccctgctagcgccgctgttgtgccccagctgcc 


BRR2            1061 EFKHIPVREEEKVELAKLLERVPIPIRERLDEPAAKINALLQSYISRQR 
                     EF+ IPVR+EEK+ELAKLLERVPIP++E +DE  AK+N LLQ+YIS+ + 
                     EFRLIPVRQEEKLELAKLLERVPIPVKEGVDESVAKVNVLLQAYISQLK 
Contig4084       376 gtacacgacggacgtgaccgagcacgagggggtggagagctcgtatcca 
                     atgttctgaaaatatcattagtctctaagtaactcatatttacatcata 
                     gcagctcgaaaacggcggtggggacgggtgcatgcggtgtgagtcagtg 


BRR2            1110 LDGFALVADMVYVTQSAGRIMRAIFEISLRRGWSSVATLSLDTCKMIEK 
                     L GF +V DMV++ QSAGRI+RA+FEI L++GW+     +LD CKM+E+ 
                     LSGFDIVTDMVFIQQSAGRIIRAMFEICLKKGWAQPMRAALDLCKMVER 
Contig4084       523 ctgtgagagagtacctggcaacgatgatcaagtgccacggcgctaagga 
                     tcgtattcattttaaccggttgcttatgtaaggcactgcctatgattag 
                     ccaccccgcgtccaattctccccgtactcagcgtaggatttcgtagtga 


BRR2            1159 RLWPTMSPLRQFPNCPSEVIRRVEKKEFPWQRYFDLDPAELGELVGVPK 
                     R+W +M+PLRQFP    E+++R E+K+FPW RYFDLD AELGEL+G+PK 
                     RMWKSMTPLRQFPRINREIVQRAERKDFPWYRYFDLDAAELGELIGLPK 
Contig4084       670 aatataaccactcaaacgagccggaagtcttattgcggggcggtagtca 
                     gtgactcctgatcgtagattagcagaatcgagatataccatgattgtca 
                     ggggtgtgcgactgcctgttgtgaggcctgcgctctcctaaaggccgcg 


BRR2            1208 EGRRVYNMVQSFPRLSVEAHVQPITRSLVRVELVINSQFNWDDHLSGTS 
                      G  + ++V  FPRL ++AHV P+TRSL+++ + +   F WD ++ G S 
                     SGAYIQSLVHKFPRLDLQAHVLPLTRSLLKINVTLTPDFQWDRNVHGAS 
Contig4084       817 aggtactcgcatcccgccgcgcccactccaaagacacgtctgcagcgga 
                     ggcatacttaatcgtatacattctcgcttatatctccatagagatagcg 
                     cacccgtttcgccacttattcgcctattcgcccttttccggtttatcct 


BRR2            1257 EAFWILVEDVDGDRLLHYEQFFLLKKYKDDEHIVNFTVPLLEPLPPCYF 
                     +AFWI+VEDVDG+ +L+++QF+L +++ +DEH V +TVP+ EP+PP Y+ 
                     QAFWIIVEDVDGENVLYHDQFILRERFAEDEHYVTITVPISEPVPPNYY 
Contig4084       964 cgttaagggggggagctcgctatcgatggggctgaaagcatgcgccatt 
                     actgtttaatagaattaaaatttgagtcaaaaatctctctcactccaaa 
                     aatgccggcgtcgttttccgtcaaggcggtgttgcccccctgtatccct 


BRR2            1306 IKIVSDRWLHSITKVPLSFQRLIMPEKFPAPTPLLDLQNAPVSSLNNPS 
                     + ++SDRWL + +K+P+SF  LI PE FP  TPLL+LQ  P+++L+N + 
                     LSVISDRWLQAESKLPISFAHLIRPEPFPPHTPLLELQPLPITALHNKA 
Contig4084      1111 ctgatgattcggaatcattgctaacgctcccactcgccctcaagccaag 
                     tcttcaggtacagatctctcattgcactccaccttatactctcctaaac 
                     gtctttggaaggcgaccgcttgcgcaatttcctgtacatggtagttcgt 


BRR2            1355 FISLYPNFKFFNKIQTQVFNSVYKTNDSVFIGAPNGSGKTVCAELALLH 
                     F SLYP F+ FNKIQTQVF +++ T+D+VFIGAP GSGKT+CAE ALL  
                     FESLYP-FEHFNKIQTQVFQALFTTDDNVFIGAPTGSGKTICAEFALLR 
Contig4084      1258 tgtctc tgctaaacacgtcgctaaggagtaggcagagaaatggtgtta 
                     tactac taataatacattacttccaaatttgcccgggactgcatcttg 
                     tgtttt cgcccgcacaccgctcttcctccctgtaacaatttggtggga 


BRR2            1404 HWSQ--EDYGTAVYIAPIQEIVDRRYEEWYGKFSDLGDGKVLVKLTGER 
                      WS+   D   AV I P QE+VD R  EW  KF  L   KV+V LTGE  
                     LWSKKGKDVPRAVCIEPYQEMVDTRVAEWSNKFEGLE--KVIVALTGES 
Contig4084      1402 ctaaagaggcaggtagctcgaggacgggttaatggcg  agaggcaggt 
                     tggaagaatcgctgtacaaattacgtcagcaatagta  atttctcgac 
                     tgcggtgtggggaccgtcgaggttaggagtcgtgagg  ggcccccgag 


BRR2            1451 SQDLKLIQVADLIFCTPSQWDSLSKRWRSMRSIQKVDFYICDELQLLGG 
                     + DL L++ AD++ CTPSQWD LS+RW++ + +Q + + I DELQL+GG 
                     TADLALLRKADVVVCTPSQWDLLSRRWKTRKDVQNIGLLIADELQLIGG 
Contig4084      1543 aggcgctcagggggtactctgtctcataaaaggcaagccagggcctagg 
                     ccatcttgacatttgcccagattcgggacgaataatgtttcaatattgg 
                     gctggagaagtttctttaggtgttaaggaggtggctgggtctgtaacct 


BRR2            1500 FYGPLYEIVISRIRYMAVQLEKNIRVVGLSVSVANARDLGEWLGTSPQC 
                       G  YE+++SR RY++ Q     R+V  SVS++NARDLG+W+G S Q  
                     DVGSTYEVIVSRTRYVSQQTGITTRIVACSVSLSNARDLGDWIGASSQT 
Contig4084      1690 gggtatggagtaaatgtccagaaaaaggtagataagagtggtaggaaca 
                     atgccaatttcgcgatcaacgtccgttcggtgtgacgatgagtgcggac 
                     tgttccggttcagatatagggcccatacctgcacttgtgttgcattcac 


BRR2            1549 IFNFSPKDRPNPLTIHLQSFSITHFPSLMLAMSKPIYRSLKNFISQRKS 
                     +FNFSP  RP PL +HLQSF++ HFPSLMLAM+KP Y S+    S  +  
                     VFNFSPAARPLPLEVHLQSFNVPHFPSLMLAMAKPAYLSMVEH-SAGRP 
Contig4084      1837 gtattcggcccccggctcttagcctctcacgagacgtctaggc tggcc 
                     ttatccccgctctatatactatcatcctttctcaccatcttaa ccggc 
                     gtctttctatctcggtggtccgtccctcgttgcacctctggac ttcgg 


BRR2            1598 TIVFTPDRKVAKQLAFDLVTFSMADEDEYLFSLMENE----AFNKVEDA 
                     TI F   RK  K  A D++T+ +AD+DE  F  +E E     + ++ D  
                     TICFVASRKQCKLTANDILTYCLADDDETRFLNVEREDLEPHLERLSDE 
Contig4084      1981 aattggtcactacagagacattcgggggactcaggaggtgcctgatagg 
                     ctgttccgaagatccaattcagtcaaaacgttatagaatacatagtgaa 
                     cccctcgcgatgctcctctgcctgtctgtaccttgaatgggcggagccg 


BRR2            1643 ALQQSLKHGIAYISEITSSNDQNIVQYLYRHGLIKVLIASR         
                      L+++L++GI Y  E  S  D+ IV  L+  G IKVL+AS+         
                     DLKETLRYGIGYYHEALSKLDKKIVTTLFEEGAIKVLVASK         
Contig4084      2128 gtagatatgagttcggcaatgaaagaattggggaagcggta         
                     ataactgagtgaaaactgataaattccttaagctatttcca         
                     tgggcggcttactcgtgcggcagtctagcggatcggtgctg         


BRR2            1684                            DVIYSLKAKSNAVIVMGTQYYD 
                                                D  +SL + +  VI+MG QY+D 
                                                DTAWSLPSTAYMVIIMGVQYFD 
Contig4084      2251 GTAAGTT  Intron 2       TAGgagtacctagtagaaaggcttg 
                     <0-----[2251   :   2301]-0>accggtccccatttttgtaata 
                                                cttgtctgtttgcccgtcatct 


BRR2            1706 GKEHRYIDYPISELLQMLGFTASIGSSELSQVILMTVTTKKEYYKKFLN 
                     G+EHRY+DY I+++LQM+G          S+ +LM   T+K+++KKFLN 
                     GQEHRYVDYAIADILQMMGRACRPTIDTSSRCVLMCQQTRKDFFKKFLN 
Contig4084      2368 gcgcctggtgaggaccaagcgtccaagattctgtatccacagttaatta 
                     gaaagataactcattattggcggcctacccggtttgaacgaattaatta 
                     cggcactttccctccaggcattcagtcctggcgggtggcagcccagcac 


BRR2            1755 EPLPMESHLQVWLHDAFVSEISTQTIESKQDAVDWLTWSYMYRRLVANP 
                     E LP+ES L  +LHD F +EI  +TIE+KQDAVDW TW+++YRRL+ NP 
                     EALPVESSLPSFLHDHFNAEIVARTIENKQDAVDWCTWTWFYRRLMQNP 
Contig4084      2515 ggtcggtatcattcgctaggaggaaagaacggggttatatttaatacac 
                     actctacgtcgttaaatacattcgctaaaaactaggcgcgtaggttaac 
                     gaggcgatagccgctccccgtaggtcgtggttttgttgcgccggaggtc 


BRR2            1804 A                           YYGLQDITHESVSEFLSDLVE 
                                                 +Y LQ  T   + E+LS+LVE 
                     G                           FYNLQGTTPTHIGEYLSELVE 
Contig4084      2662 gGTGAGTA  Intron 3       CAGttaccgaacacaggtctgcgg 
                     g<0-----[2665   :   2716]-0>taatagccccatgaatcatta 
                     a                           tccagccattttcacatatca 


BRR2            1826 TTMNDLSEARLITVDDEDDSCVALNLAMIASHYGITYITMQTFALSLSE 
                     TT+NDL  +  I + D+ D+    NL MIAS Y I+YIT++ F+ S+ E 
                     TTLNDLVNSDCIIIQDDMDT-LPNNLGMIASFYYISYITVEIFSQSIKE 
Contig4084      2780 aatagtgatgtaaacggaga ccaatgaagttttattaaggattctaag 
                     cctaattacagtttaaatac tcaatgttcctaatcatctattcactaa 
                     ccgtcgccgtctccactgcc ccccatgtactcccaccccacctaccaa 


BRR2            1875 RTKMKGLLEIVTSAAEYEQLPIRKYEDIVLERIHSRLPVRLSNPNYEDP 
                      TK+KGLLEIV+SA E+E +PIR +ED +LERI+ R+PV+++  +Y  P 
                     TTKLKGLLEIVSSAHEFETVPIRHHEDTLLERIYDRVPVKVAKVDYSSP 
Contig4084      2924 aaacagtcgagttgcgtgagcaaccggaccgaatgcgcgaggaggtatc 
                     ccatagttattcccaatactctgaaaacttagtaagtctatcataagcc 
                     tcacgcgtatctagtgtgctgcgctactttggtcctgttgtcactccac 


BRR2            1924 HTKSFILLAAHFSRFELPPGLVIDQKFILTRVHNLLGACVDTLSSEGHL 
                     + K+F+LL AHFSR  LPP L IDQ  IL ++  LL A VD +SS+  L 
                     YFKTFLLLQAHFSRTTLPPDLAIDQSTILGKIIGLLSAAVDVMSSKS-L 
Contig4084      3071 ttaatccccgctacaacccgtgagctaacgaaagcctgggggataaa t 
                     atacttttacatggcctccatctaaccttgattgttccctattcgag t 
                     tcatccgtattcccgcttccgtctattttcgactttactgttgccgt g 


BRR2            1973 IACIRPMEMSQMVTQALWDRDSPLKQIPYFDDALIERCNKEGVHDVFDI 
                     + C+  M++SQM  QA+WDRDSPLKQ+PYFD  ++ R   +G+  V+DI 
                     LGCLGAMDLSQMCVQAMWDRDSPLKQVPYFDADVLGRFKAKGLDSVYDI 
Contig4084      3215 cgttggagcacatgcgatgagtctacgcttggggcgatagagtgtgtga 
                     tggtgctatgatgtactgagacctaatcatacattggtacagtactaat 
                     tatgtggcttagtgggggtgtatggggcctcccctgacgcgtgccgtcc 


BRR2            2022 IDLDDEKRTELLHMDNAH                              A 
                     ++L+D++R +LL M++                                A 
                     MELEDDERNDLLRMNDRQ           L:L[ctt]           A 
Contig4084      3362 agcggggaagttaaagacCTGTACGTT  Intron 4       CAGTg 
                     tataaaagaattgtaaga  <2-----[3418   :   3471]-2> c 
                     gggattagttggggtcag                              g 


BRR2            2042 KCAEFINKYPDIDIDFEIEDSEDVHANSPSVLIVQLTRELEEDEEVDTT 
                     + A+F+N YP+I++ + +ED+  + ++ P VL + L RE +E    D   
                     RVAKFVNSYPNIEVSYHVEDASSLTSSDPVVLNITLDREADEGNPEDQV 
Contig4084      3476 cggatgattcaaggttcggggttcattgcggcaaacgcgggggacggcg 
                     gtcattacacatatcaataaccctcccactttatctagacaagacaaat 
                     atcgccttttttgttcccacctttctcctcgcttcgtcatcacctacag 


BRR2            2091 VIAPYFPAQKTEHWWLVISDDKT--LLAIKKITLGRSLTTKMEFVPPAM 
                       AP+FP +K   WWLV+ D+KT  L AIKK+T+  +L TK+EF  P   
                     ADAPHFPHKKMVSWWLVVGDEKTKSLYAIKKVTVKATLKTKLEFTLPE- 
Contig4084      3623 gggcctccaaagtttcgggggaaatttgaaagagagacaaacgtaccg  
                     caccatcaaattcggtttgaaacactactaatctacctacatatctca  
                     ctacccttgggcaggcggtcagcaggcgcggcttagatgtgtacacta  


BRR2            2138 GTLKYKLSCFSDSYMGVDYEKEFECNVLEPLDTEMEDGE           
                     G    KL  + DSY G D   +F+   L+ ++ E  D E           
                     GEWNLKLFLICDSYAGAD--QDFDIETLKVVEGESSDEE           
Contig4084      3767 ggtatacttatgatgggg  cgtgagacagggggatggg           
                     gagatattttgagacgca  aatatactattagagcaaa           
                     aggcgggcgcttctaagc  gcttcgttgagaggctcgg           


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