单基因分析新思路：联合ChIP-Seq

作者: 科研菌 | 来源:发表于2020-04-24 00:10 被阅读0次

今天给大家分享2020年3月Int J Mol Sci(IF=4.183)杂志上的文章“NR2F2 Orphan Nuclear Receptor is Involved in Estrogen Receptor Alpha-Mediated Transcriptional Regulation in Luminal A Breast Cancer Cells”。在这篇文章中作者利用了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）证明了NR2F2通过对ERα超级增强子的作用参与ERα介导的转录调控。

NR2F2 Orphan Nuclear Receptor is Involved in Estrogen Receptor Alpha-Mediated Transcriptional Regulation in Luminal A Breast Cancer Cells

在管腔A型乳腺癌中孤核受体NR2F2参与雌激素受体α（ERα）介导的转录调控

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一.研究背景

乳腺癌为女性多发的癌症，其癌细胞中的雌激素受体α（ERα）是内分泌治疗的靶点。ERα作为核受体，可在配体的作用下与DNA调节元件结合，改变特定基因的活性，从而正向或负向调节其靶基因的表达。目前，在ERα调节复合物中已鉴定出大量的协同调节剂。

NR2F2目前没有检测到天然配体，因此为孤核受体。NR2F2在器官生成、血管生成和淋巴生成发挥作用。同时其在ER阴性癌症中表达较低，以细胞类型和药物特异性形式参与化疗耐药。此外其可以和基序AGGTCA结合与另一个核受体形成同二聚体或异二聚体。同时，NR2F2与核受体基序的结合非常灵活，它可以识别其他核受体的基序如：ERα，肝细胞核因子4α（HNF4A），甲状腺受体（TR），维生素D受体（VDR））。

超级增强子（SEs）是一大类增强子，它们在物理上彼此接近，通常远离靶基因启动子，并且与转录因子和活性染色质区域（如H3K27ac）的高密度结合相关。

二.分析流程

三.结果解析

1.高NR2F2表达与管腔A型乳腺癌较好预后相关

作者将患者分为组织学浸润性导管癌（IDC）组、浸润性小叶癌（ILC）组和IDC / ILC混合组。进一步将IDC组进行PAM50亚型分型，而ILC和混合型90%管腔A型，不继续分组。得到IDC Her2组、IDC basal组、IDC LumB组、IDC LumA组、ILC组和混合组。其中ER阴性乳腺癌为IDC HER2组+ IDC basal组；ER阳性乳腺癌为IDC LumB组+IDC LumA组+ILC组+混合组。

图1A：比较6组的ESR1和NR2F2的mRNA表达，ER阴性组ESR1和NR2F2低表达，而ER阳性组ESR1和NR2F2高表达。

图1B：比较低NR2F2表达和高NR2F2表达在ER阴性乳腺癌和ER阳性乳腺癌的生存情况，发现低NR2F2表达和高NR2F2表达在ER阴性乳腺癌无复发转移情况没有显著差异；而在ER阳性乳腺癌中，高NR2F2表达组无转移生存优于低NR2F2表达组。

图1C：进一步研究低NR2F2表达和高NR2F2表达在管腔A型和管腔B型乳腺癌的生存，发现低NR2F2表达和高NR2F2表达在管腔B型乳腺癌无复发转移情况没有显著差异，而在管腔A型乳腺癌中，高NR2F2表达组无复发转移情况优于低NR2F2表达组。

因此，NR2F2在ER阳性管腔A型乳腺癌中具有重要作用。

图1. NR2F2在各类型乳腺癌中的作用

2.管腔A型乳腺癌细胞中NR2F2和ERα结合位点有重叠

对两个管腔A型乳腺癌细胞（MCF-7和T47D）使用NR2F2和ERα抗体进行染色质免疫沉淀并测序（ChIP-seq），并将测序信号合并统计样品峰信息。由于MCF-7是癌细胞，可能存在拷贝数增加或减少，作者使用 HMCan程序对改变的拷贝数进行归一化。最后检测到38,107个NR2F2结合位点和121,097个ERα结合位点。

图2A：使用基因浏览器IGV展示NR2F2和ERα ChIP-seq的峰，发现NR2F2 峰和ERα 峰在多个ERα靶基因（如：TFF1、GREB1和XBP1）上有重叠。

图2BC：使用diffBind分析NR2F2和ERα 的重叠区域，发现有90%NR2F2结合位点与ERα重叠。

图2D：对比单ERα结合位点（只结合ERα的位点）、单NR2F2结合位点（只结合NR2F2的位点）和ERα和NR2F2共有结合位点的信号强度，发现在共有位点上ERα和NR2F2信号强于单ERα位点和单NR2F2位点。

图2E：使用ChIP-seq数据集中活化组蛋白修饰信息确定ERα和NR2F2结合位点的特定调控元件。对比共有结合位点与单ERα结合位点的组蛋白活化信号，发现共有结合位点在组蛋白H3K27ac（与基因激活相关，主要富集在增强子和启动子区域）和H3K4me1（增强子的标志）的信号比单ERα结合位点强，而H3K27ac和H3K4me1同时修饰说明增强子激活起促基因作用。

同时，使用T47D验证也得到相同结果。

因此，大多数NR2F2结合位点与ERα结合位点在活化增强子区域重叠。

图2. 探究NR2F2与ERα 是否相互作用与作用位置

3.NR2F2与共调节因子FOXA1和GATA3共同与ERα结合位点结合

图3A：使用HOMER软件进行基序富集分析，共有位点以及单独ERα结合位点显示FOXA1、GATA3、AP-1和AP2γ基序富集；雌激素反应元件（ERE）基序只在单独ERα结合位点富集；CTCF基序在单独NR2F2结合位点富集。

图3BC：对MCF-7进行FOXA1, GATA3 和 CTCF ChIP-seq，发现在FOXA1和GATA3中共有位点信号比单NR2F2位点和单ERα结合位点强；而在CTCF中，单NR2F2位点信号最强。

因此，NR2F2与ERα调控复合物结合存在辅助因子FOXA1和GATA3。

图3. NR2F2与ERα相互作用存在共调节因子FOXA1和GATA3

4.NR2F2 有利于ERα超级增强子的形成

图4A：IGV展示了ERα超级增强子的母子区域与NR2F2和ERαChIP-seq信号，发现在超级增强子区域中有NR2F2和ERα信号，其中在母区域信号强。

图4B：对比ERα和NR2F2在超级增强子中母区域与子区域的结合强度，使用ERα和NR2F2的RPKM值代表结合强度消除母子区域长度对结合强度的影响，说明发现ERα或NR2F2在母区域结合强度大。

图4C：使用ENCODE数据库上的ERαChIA-PET处理MCF-7细胞的数据，根据环数（ERα介导的染色质相互作用）分成3组即大于2个组、1个组、0个组，发现ERα和NR2F2在大于2个组密度大，即与高频ERα结合环结合强度大。

图4D：比较母子区域中NR2F2结合的ERα环比例，发现高频ERα环在母区域占比大。

因此，NR2F2与高频ERα介导的染色质相互作用在与ERα结合的超级增强子母区域富集，对ERα结合的超级增强子有重要作用。

图4. 探究NR2F2 是否对ERα超级增强子有作用

5.乳腺癌细胞中NR2F2参与ERα介导的基因表达（验证）

作者使用shRNA方法沉默NR2F2，然后进行mRNA测序

图5A：对比沉默NR2F2与不沉默中NR2F2的NR2F2结合位点相关基因的表达，发现388个下调基因和524个上调基因。

图5B：通过RT-qPCR验证BAMBI、VEGFA、KRT15和HEY2等基因的表达水平。

图5CD：GSEA分析沉默NR2F2下调基因与上调基因的生物学功能，发现沉默NR2F2后下调基因与基因集DREAM有关，上调基因与雌二醇处理上调基因和内分泌耐药细胞中的下调基因很相似。

图5E：沉默NR2F2后，与ERα结合的超级增强子相关的大多数基因表达水平发生改变。

图5F：EGR3基因NR2F2和ERαChIP-seq信号的变化。

图5. 沉默NR2F2验证NR2F2对ERα介导的基因表达的作用

最后小结一下，作者首先通过分析了TCGA -BRCA的表达数据证明高NR2F2表达与管腔A型乳腺癌较好预后相关。其次，作者对两个管腔A型乳腺癌细胞染色质免疫沉淀并测序，发现全基因组的NR2F2和ERα有结合位点重叠。随后，作者探究了NR2F2和ERα的共调节因子，发现有FOXA1、GATA3参与作用，且作用位置在活化增强子区。进而，进一步探究NR2F2与由ERα结合的形成的超级增强子，发现NR2F2在着过程起重要作用。最后作者通过shRNA沉默NR2F2验证了结论。

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