eRNA文献阅读

最近的一次组会上，又听到老板在和Steven探讨一个我没有听说过的一个名词：eRNA。我后来查了一下，这个名词已经不新了（好几年前就出现过了），又一次证明了自己的孤陋寡闻。。。所以这篇笔记就是关于eRNA的文献阅读。

文献题目：Enhancer-derived RNA: A Primer
发表时间：2017

摘要

Enhancer-derived RNAs（eRNAs）是一类从转录增强子区域由RNA pol II转录出来的RNAs，是基因组中一类顺式元件。在最近的研究中，越来越多的证据表明在转录调控过程中eRNA的产生和增强子活性之间有关。另外，eRNA也可作为鉴定增强子的标志。这篇综述主要讲eRNA的发现以及特征。

前言

新一代测序(NGS)技术的爆炸性增长使得我们可以研究基因组水平上的转录活性。NGS不仅使从编码序列中详尽地分类转录本成为可能，也有促进了许多不作为蛋白质合成模板的RNA的发现。在过去的十年中，许多研究表明，包括小RNAs (miRNAs)和长非编码RNA (lncRNAs)在内的几类非编码RNA (ncRNAs)发挥着不同的生物学作用，如转录后调控mRNA的稳定性，以及染色质活性的表观调控。这些研究极大地丰富了我们对基因组的构成的理解以及功能调控。

在非编码RNA家族中，一个较晚出现、与传统“成员”不同的是增强子衍生RNA (enhancer-derived RNAs, eRNAs)，它们在增强子位点被转录（图1）。与其他顺式调控元件（CREs）一样（比如启动子和绝缘子），增强子包含不同转录因子(TFs)的结合位点（长度在6 bp到20 bp之间的DNA motif序列）。通过与几个TFs结合，每个增强子充当成核位点形成大的多蛋白复合物，从而激活基因转录。最近的研究表明，人类基因组中含有几百万个增强子，这些增强子可以在不同的发育阶段、不同的组织和细胞类型中被激活。

增强子和TFs是基因调控的主要调控者，而其他能够化学修饰DNA和组蛋白的因子正逐渐被加入基因调控的体系，其中许多因子通过调节染色质的可接近性，从而直接与TFs和增强子相互作用。到目前为止，一些能够添加/去除甲基、乙酰基和磷酸基团到DNA和组蛋白尾部上的酶，被认为是关键的基因调节因子。一般认为这些因子的参与会影响额外的调控水平，从而提高基因表达模式的特异性。然而，这么多的因子在不同程度的叠加功能，是如何被整合到单一的转录调控过程中的，在概念上认知基因调控仍然是一个阻碍。而意外的发现eRNAs也产生了一个问题:它们是否参与基因的调控机制。

图1：一个典型的基因与两种顺式调控元件有关：TSS近端启动子，以及其他远端元件（比如增强子）。除了管家基因，一个基因的增强子在未活化状态下，其转录活性通常是“关闭”的（A）。然而，当一个enhancer被转录因子激活，它可以形成一个loop，在物理空间上接近启动子，“开启”基因的转录（B）。在之前的研究中，启动子和增强子都被分为非编码元件，然而最近的研究表明，激活的增强子被双向转录成eRNAs。也称为enhancer-derived RNA。

什么是eRNA？

尽管处于活性状态的增强子的转录在90年代初就有报道，但2010年的两篇报道使eRNAs受到关注。在这两项研究中，高通量测序被用于鉴定刺激依赖性增强子，出人意料地揭示了RNA聚合酶II (RNAPII)介导的双向eRNAs转录，通常为0.5-2 kb长度(图1B)。此外，eRNAs的表达水平与顺式调控活性相关(即依赖于环境，增强子刺激附近基因的mRNA合成)，表明增强子功能与eRNA的产生密切相关。通过对哺乳动物基因组联盟(Mammalian genome, FANTOM) 和DNA元件百科全书(ENCODE)中功能元件的系统特征功能注释，增强子合成的RNA很快在大多数人类细胞系和组织中得到证实。

怎么检测eRNA？

由于eRNAs的丰度比基因转录本低19 - 34倍，相比于常规RNA-seq， NGS需要更高的覆盖率来准确定位增强子的转录位置。在首次报道的eRNA合成研究中，增强子的转录本在测序实验中被检测到，使用的是总RNA，而不是polyA+的 RNA，虽然在后来的研究中发现部分eRNAs与其他lncRNA类似，也存在polyA。

eRNAs不像mRNA那么稳定。因此，需要开发一个更准确的捕获eRNAs的方法，如GRO-seq和PRO-seq。另外一种比较灵敏的检测eRNAs的方法是对基因表达的cap分析(CAGE)测序。这种方法被FANTOM联盟来分析大量的人组织和细胞系的转录本，其中有43,011个增强子元件被转录成eRNA。

为了帮助富集eRNAs，使用染色质免疫沉淀(ChIP)可以把组蛋白variants(如H2AZ)或修饰蛋白(如H3K27ac和H3K4me1)用抗体拉下来，进行eRNA检测实验。另一种增强eRNA检测的方法，叫BruUV-seq，使用紫外线介导的转录阻断DNA损伤，然后用Bru标记，对新生RNA进行深度测序。

此外，像其他RNA转录本一样，eRNAs可以用互补RNA原位杂交探针（标记有生物素或者荧光素）进行可视化。当同时使用两个或两个以上RNA探针检测eRNA和附近编码蛋白质转录本的时候，增强子的转录活性与其基因调节功能之间的动态关系也可以被研究。

虽然这些方法都提供了客观的方法来验证eRNAs的特征，但增强子只在特定的组织和细胞中有活性。因此，在原则上，活性增强子的转录只会在空间和时间上受到限制。因此，分析eRNA动态表达模式，是最能揭示在特定背景下增强子的功能活性的。

eRNA的功能

尽管eRNA合成和增强子活性之间有很强的关联性，但是尚不清楚这两者之间联系的机制。一方面，有研究认为eRNAs可能作为转录激活因子发挥作用；另一方面，eRNAs可能只是一个假的转录的结果，因为RNAPII被招募到临近的增强子上。注意，后者不是一个简单的假设，因为根据ENCODE的发现，大约80%的人类基因组是能够被转录的，但不到50%的基因组已知包含CREs和编码序列。这提示大约30%的基因组的转录活性可以发生在非编码基因或CREs上。

为了支持eRNAs在增强子活性中的作用，一篇文章使用RNA干扰(RNAi)来抑制人类细胞系中的几个eRNAs，发现了eRNAs在转录激活中起作用的证据。此外，其他研究表明eRNAs可以与 Mediator和其复合物相互作用，建立染色质loop，这对增强子和启动子之间的相互作用至关重要。然而有研究表明，抑制eRNA的方法是使用传统RNAi技术，这是eRNA大部分位于核内，RNAi在核内的作用不像在细胞质内的作用有效。

一个更严格的研究eRNA功能的方法，是通过在其转录起始位点附近插入一个多腺苷酸化片段来干扰其合成，从而使转录提前终止。在最近的研究中，该方法应用于调节cdkn1b表达的增强子的位点。值得注意的是，虽然这个增强子的转录被降低了90%，但其靶基因cdkn1b的转录基本上是完整的。这表明，这个eRNA是基因转录过程中的惰性副产物。然而，由于使用这种方法来截断eRNA产物还没有大规模的运用，尚不清楚有多少eRNAs对增强子活性也是可有可无的。

eRNA是增强子的标志

自从人类基因组计划的完成，一个主要的科学重点是开发有效的手段精确地绘制出数百万CREs在每个细胞类型和不同发育阶段中，不同的基因表达模式的调控。目前，全局增强子mapping方法主要依赖于与增强子激活相关的三个参数:(1)TF结合，(2)增强子位点的组蛋白修饰，(3)可接近的“开放”的染色质。这里值得注意的是，“开放”染色质是那些在增强子激活过程中的状态，而不是它的原因或结果。无论eRNAs是否有助于增强子的功能，高通量eRNA检测可以帮助我们定位global增强子。

事实上，数千个增强子通过分析非编码序列的转录本被发现，与组蛋白chip-seq生成的增强子map有很好的重叠。增强子活性和在某一染色质区域的eRNAs表达水平之间的高度关联性，使研究能够以eRNAs作为替代去研究短发夹或小分子(如JQ1)抑制转录因子的调控作用。在这些研究中，一对一的比较eRNAs和蛋白质编码转录本提供了一个直接建立增强子与其附近基因之间联系的机制。

随着高通量测序的成本迅速降低，随着时间的推移，精确测定eRNAs的方法变得更加可行。鉴于RNA-seq通常用于鉴定细胞和组织的基因组特性，使用eRNAs来预测增强子的活性可以避免额外的实验来确定增强子。这比其他增强mapping技术（如ChIP-seq, dnas -seq和ATAC-seq分析）都有优势。因此，eRNA分析在标本有限的情况下(例如在临床中)就会特别有用。例如，He et al.等人最近在非髓样甲状腺癌(NMTC)中，发现在染色体4q32 (4q32A > C)上的超罕见单核苷酸突变。有趣的是，该区域的eRNAs表达水平在NMTC肿瘤中显著下调，这提示其可作为NMTC肿瘤标记的增强子活性。eRNA测量可用于验证导致疾病的突变。在另一项研究中，雄激素受体调节的eRNAs (AR-eRNAs)被用于监测去势耐药前列腺癌(CRPC)对第二代抗雄激素化合物enzalutamide的应答，从而发现了许多有助于因enzalutamide耐药而抑制CRPC生长的基因位点。

eRNA研究的前景

对于eRNAs的生物学功能，特别是关于它们与增强子活性的关系，仍然缺乏广泛的共识。这并不完全出乎意料，因为eRNA只是在6年前才为人们所知。对于这个比较年轻的ncRNA成员今后会有更多的研究以形成一个成熟的结论。在这个方向上，一个值得注意的领域是发展在细胞中操作eRNAs的新工具，这对于功能研究和开发eRNA作为治疗靶点都是至关重要的。一个潜在的有用的方法是锁定核酸(LNA)技术，可以更高效率的靶向细胞核内的eRNA，这比传统的RNAi技术更有用。此外，最近开发的(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)技术使得进行大规模基因组编辑实验成为可能。系统地操控eRNA的合成，例如，通过靶向在增强子位点插入转录终止信号，会更全面的了解eRNA在顺式调控增强子活性的作用。

到目前为止，一些研究已经暗示了eRNAs在Mediator和其复合体中的作用，而后两者介导染色质形成loop。在未来，对eRNAs结合蛋白的深入分析可能有助于阐明在转录调控过程中eRNAs在哪里以及如何参与复杂的相互作用网络。这可能需要开发一系列的方法来系统的鉴定eRNA相互作用蛋白。

最后，随着破译正常组织和疾病组织的表观基因组的需求日益增长，需要更加灵敏和更加全面的方法来描述各种细胞环境中的增强子。值得注意的是，在过去的十年里，有大量关于疾病相关的遗传变异(例如，单核苷酸多态性和拷贝数变异)和突变的记录，而大部分都位于潜在的增强子元件上。由于eRNAs是一种有效的活性增强子标记，对其进行靶向测序和生物信息学分析会加速对人类疾病中这些遗传变异和突变的功能注释。