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血红素加氧酶（HO）催化血红素氧化降解为胆绿素，亚铁和一氧化碳（CO），HO-1具有多种生物学作用，如血红素解毒，铁循环，氧化应激反应和炎症调节。最近的研究已经揭示了增强子RNA（eRNA）在转录调控中的作用，所述增强子RNA（eRNA）是由基因增强子区域转录的长非编码RNA。然而，目前尚不清楚eRNA是否参与人血红素加氧酶-1（HO-1）诱导的调控。
本文作者报道多个核富集的eRNA是从邻近两个HO-1增强子的区域转录的（即远端E2和近端E1增强子），并且这些eRNA中的一些由氧化应激引起的马来酸二乙酯（DEM）诱导。
作者证明了由人类HO-1E2增强子区域（命名为人类HO-1增强子RNA E2-3;此后称为eRNAE2-3）转录的一个正向（5→3）eRNA的表达由DEM诱导在HeLa细胞中依赖于NRF2。相反，HO-1转录阻遏物BACH1的敲低进一步增加了DEM诱导的eRNA E2-3转录以及HO-1的表达。
此外，还发现敲低eRNA E2-3选择性下调DEM诱导的HO-1表达。eRNA E2-3敲减减弱了DEM诱导的PolII与HO-1的启动子和E2增强子区域的结合，而不影响NRF2募集到E2增强子。这些发现表明eRNAE2-3是功能性的并且是HO-1诱导所需的。
图1 HO-1eRNA调控HO-1的表达
DEM诱导RNA polⅡ和NRF2结合到HO-1增强子促进eRNA合成
HO-1诱导依赖于位于人细胞中转录起始位点上游约4和9kb的基因增强子称为增强子1（E1）和增强子2（E2）。这些增强子区域含有几个转录因子的结合位点，包括与TPA响应元件（TRE）和抗氧化剂反应元件（ARE）重叠的多个应激反应元件（StRE）。
HO-1表达受激活因子NRF2（核因子红细胞来源的相关因子2）和阻遏蛋白BACH1（BTB和CNC同源性1）之间的平衡调节，二者均与StRE结合。
作者首先通过ChIP-qPCR实验检测表明RNA polⅡ结合到HO-1的启动子和增强子E1和E2上，并且DEM诱导后，RNA polⅡ结合到HO-1的启动子增强子区域增加（下图C），NRF2结合到HO-1的启动子区并且受DEM诱导结合增加（下图B）。
图2 RNA polⅡ和NRF2结合到HO-1增强子区
随后作者使用人类Cap相关基因表达的全面的cDNA数据库寻找来源于除蛋白编码区域以外的HO-1基因座的cDNA标签，发现在HO-1转录起始位点上游存在4个转录本：两个来自与E2增强子相邻的区域，一个来自E2和E1增强子之间的区域，而第四个来自E1增强子。
为了验证来源于HO-1增强子区域的转录物的存在，用DEM处理的HeLa细胞的总RNA RT-PCR分析在人HO-1增强子区域周围进行转录物作图 cDNA合成引物（下图A），使用5'末端引导的和3'末端内部引物进行cDNA合成的链特异性RT-PCR分析发现eRNA E2-1是反向（3→5）信号，而eRNA E2-2和eRNA E2-3是正向（5→3）信号，eRNA E1-3和E1-4都是正向（5→3）信号。
图3 DEM诱导HO-1 eRNA表达
NRF2促进eRNA和HO-1表达，BACH1抑制eRNA和HO-1表达
NRF2是一种环境应激反应转录激活因子，能激活包括HO-1在内的上百个基因的表达，作者对NRF2敲低后分别检测HO-1和HO-1 eRNA的表达，结果表明NRF2敲低后HO-1和其eRNA E2-3的表达也明显降低了。
图4 NRF2调控HO-1基因和eRNA的表达
作者随后对HO-1比对抑制剂BACH1进行敲低后检测HO-1和eRNA的表达，结果表明BACH1敲低后，HO-1和eRNA的表达上升。表明了HO-1和其eRNA表达的相关性。
图5 BACH1调控HO-1基因和eRNA的表达
HO-1 eRNA在细胞核中表达后通过影响RNA polⅡ与HO-1启动子结合调控HO-1基因的表达
作者通过核质分离分别检测HO-1 eRNA在DEM诱导和非诱导细胞的细胞质和细胞核中的表达，表明eRNA是在细胞核中表达并且受DEM诱导表达增加，如下图：1和3是未经DEM处理，2和4是经DEM处理的。说明HO-1 eRNA可能是在细胞核内起调控作用。
图6 核质分离检测eRNA的表达
通过核质分离实验表明HO-1 Erna是在细胞核中起作用，然后作者对eRNA E2-3进行siRNA干扰后通过ChIP实验检测NRF2和RNApolⅡ与HO-1启动子和增强子区域的结合，表明E2-3调控RNA polⅡ与HO-1启动子和增强子的结合。
图7 E2-3影响RNApolⅡ与HO-1启动子和增强子的结合
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对eRNA E2-3进行siRNA干扰后分别检测HO-1 mRNA和蛋白的表达，表明eRNA敲低后，HO-1 mRNA和蛋白表达降低，说明eRNA E2-3通过影响RNA polⅡ与HO-1启动子和增强子的结合调控HO-1基因的表达。
图8 eRNA E2-3对HO-1基因表达的影响
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