大家好，本期我们通过3篇高分文章来解读简化甲基化测序（RRBS）技术优势及研究成果（医学+物种保护+农学）。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。DNA甲基化测序方法较多，研究者可以根据实验目的选择最佳的研究方案。如在研究调控区域甲基化状态的应用场景中，RRBS就是最具性价比的方法之一。
关于RRBS
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
为了适应科研技术的需要， 可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力低样本量多维度分析， 富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
技术优势
精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。
重复性好：多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%，适用多样本间的差异分析。
性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。
案例分析1：肠道功能鉴定（团队文章）
RRBS揭示肠道对早产的快速适应涉及喂养相关的猪肠道基因DNA甲基化重编程
Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
研究摘要：
早产后，未成熟的肠道功能和免疫功能必须迅速适应细菌定植和肠内喂养。作者为验证肠道表观遗传变化与早产及首次喂养时的肠道反应有关，以仔猪为模型，对早产猪和足月猪进行全肠外营养（TPN）或部分肠内喂养5天，然后用牛奶进行纯肠内喂养，直到第26天（断奶年龄）。比较分析早产猪和足月猪在第0天、第5天和第26天的肠道结构、功能、微生物组、DNA甲基组和基因表达（每组n=8）。RRBS结果显示，出生时早产猪肠道出现绒毛萎缩和整体高甲基化，影响与Wnt信号通路相关的基因。在生命的前5天，高甲基化相关的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表达明显降低，但大多数早期甲基化差异在第26天消失。直到第26天，早产猪的蔗糖酶和麦芽糖酶活性仍然降低，肠道微生物群发生改变。0-5天期间显示许多新的甲基化差异，主要表现在未提供肠内喂养（TPN喂养）的情况下。这些甲基化差异影响了与细胞代谢相关的肠道基因，包括通过启动子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表达。总之，未成熟肠道在早产后可迅速适应其基因甲基化和表达的能力，只有少数早产相关缺陷会持续到断奶。结果表明早期肠内喂养对于刺激肠道基因的甲基化重编程可能很重要，从而使肠道快速适应早产环境。
早产猪和足月猪肠道的甲基化差异
案例分析2：物种保护（团队文章）
RRBS+RNA-seq揭示迁地保护金丝猴（Rhinopithecus roxellana）的表观遗传和转录特征
Du Zhang,et al. Epigenetic and transcriptional signatures of ex situ conserved golden snub-nosed monkeys (Rhinopithecus roxellana). Biological Conservation 237 (2019) 175–184
研究摘要：采集野生和圈养金丝猴的血液样本，研究人员使用简化甲基化RRBS和转录组RNA-seq进行测序分析，发现圈养组金丝猴的DNA甲基化和基因表达与野生组相比均存在显著差异，这和人类圈养组金丝猴的特定食物供应和圈养环境与管理措施有关。KEGG通路分析显示，差异表达基因在广泛的生理功能通路中富集，且大部分与免疫和代谢功能相关，特别是自噬相关通路中的一组核心基因如ATP6V0A1和PPM1D均存在相关联的差异DNA甲基化和基因表达。研究结果表明，迁地保护金丝猴对人类干预保护表现出明显的表观遗传和转录适应，这一结果为未来生物标志物的开发提供基础，表观遗传和转录特征或可用于濒危动物物种迁地保护计划中的风险评估。
DMR和DEG汇总
案例分析3：动物育种
RRBS揭示不同孵化温度和CO2浓度中的鸡心脏组织全基因组DNA甲基化
Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
研究摘要：
孵化过程中的温度和CO2浓度对肉鸡的发育有着深远的影响。此前许多研究发现这些参数的差异对孵化心重 (heart weight，HW) 有显著影响。早期生活环境也被证明会影响肉鸡后期的生产性能，因此表观遗传机制可能介导环境刺激引起的长期生理变化。作者利用RRBS技术评估84只在两种不同蛋壳温度（EST；37.8℃和38.9℃）和三种CO2浓度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉鸡幼体心脏组织的DNA甲基化模式，并进行差异甲基化分析。
研究结果验证了ABLIM2、PITX2和THRSP三个基因的甲基化和表达的协调变化，确定孵化后小鸡心脏的差异甲基化模式与孵化EST和CO2的差异有关，并且这种差异可能通过转录因子结合和基因表达的变化影响心脏的生长和发育。此外，本研究还鉴定了负责调节体温的其他器官（包括下丘脑和甲状腺）的表观遗传模式可能有助于表征调节心脏发育的温度驱动差异机制。总之，对早期生活环境影响的表观遗传特征了解可以作为未来动物表现预测因子，从而有利于动物育种。
RRBS绘制DNA甲基化图谱概述
参考文献：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00565/full
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.558189/full
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006320719302149?via%3Dihub
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