methylKit 进行差异甲基化分析

methylKit 是一个用于分析甲基化测序数据的R包，不仅支持WGBS，RRBS和目的区域甲基化测序，还支持oxBS-sq, TAB-seq等分析5hmc的数据。 其核心功能是差异甲基化分析和差异甲基化位点和区域的注释。

安装过程如下:

source(“http://bioconductor.org/biocLite.R“)
biocLite(“methylKit”)

推荐使用最新版本的R进行安装，这样可以使用最新版本的methylKist。
利用methylKit 做差异分析包括3步

1. 读取原始数据

每个样本一个原始数据，methylKit支持两种格式的methylation calling文件

• 纯文本格式

  内容如下

每一行是一个甲基化位点，coverage 代表覆盖这个位点的reads数，freqC 代表甲基化C的比例，freqT 代表非甲基化C的比例。这种纯文本格式内容非常直观，文件大小相比bam 文件小很多，读取的速度更快。
纯文本格式的读取过程如下

treatment参数指定样本的分组，0代表control组，1代表treatment组

• bam文件

直接读取Bismark软件比对产生的bam文件，通过processBismarkAln实现
用法如下：

2. 合并所有样本的数据

将所有样本的甲基化情况合并，得到所有样本的甲基化表达谱，用法如下

meth=unite(myobj, destrand=FALSE)

meth 中的内容如下，其实就是之前的methylation calling文件的合并

在合并的过程中，默认情况下，只有所有的样本都包含该位点时，才会保留，本质就是取的所有样本的交集，如果你想要取并集，可以修改min.per.group参数的值，该参数的值代表每组中至少有多少个样本覆盖该位点时才保留，如果设置为1，就是取并集。

meth.min=unite(myobj,min.per.group=1L)

3. 执行差异分析

通过calculateDiffMeth函数来执行差异甲基化分析，用法如下

myDiff=calculateDiffMeth(meth)

根据甲基化C是变多了还是变少了，可以将差异甲基化的结果分为两大类：

1. hypermethylated

2. hypomethylated

hypermethylated表示相比control组，treatment组中的甲基化C更多；hypomethylated则相反，表示treatment组中的甲基化C比control组中少。
采用getMethylDiff函数提取差异分析的结果，用法如下

difference函数表明差异的阈值，只有差异大于该阈值时，才会保留，起始就是meth.diff的值，注意是绝对值大于difference的值。

除了difference阈值之外，还有qvalue阈值，小于该阈值的结果保留。在methylKit中，校正p值采用的是SILM算法，和我们常规的BH算法不同。
type参数定义差异的类型，如果你只关注hypermethylated或者hypomethylated，可以设置type 参数的值，单独筛选。

在methylKit中，它的差异分析总是针对合并后的甲基化表达谱，如果你的甲基化表达谱每一行是一个甲基化位点，那么差异分析的结果就是差异甲基化位点；如果你的表达谱每一行是一个甲基化区域，那么差异分析的结果就是差异甲基化区域。上面的例子都是针对差异甲基化位点的，下面看下差异甲基化区域的分析。

首先遇到的问题就是甲基化区域如何界定，在methylKit中，按照滑动窗口的方式定义甲基化区域，默认窗口大小为10000 bp ，步长为10000bp,通过tileMethylCounts函数实现。

完整的差异甲基化区域分析的代码如下：