2023-04-10

Nat Rev | 单细胞和空间多组学的方法和应用

原创 夏天 图灵基因 2023-04-10 11:52 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：夏天

IF=59.581

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、文章主要介绍了单细胞和空间多组学技术（也称为多模态组学方法）等快速发展领域的进展，以及跨这些分子层整合信息所需的计算策略。

2、文章展示了单细胞和空间多组学技术对基础细胞生物学和转化研究的影响，并讨论了当前的技术挑战以及对未来的展望。

近日比利时鲁汶大学单细胞组学研究所的研究人员Thierry Voet等人在《Nature Reviews Genetics》杂志上发表了名为“Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics”的综述文章，就现代单细胞和空间多组学的基本技术和计算原理、技术现状和应用价值进行了综述。文章指出，对单细胞的基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组和/或代谢组的联合分析，正在改变我们对细胞生物学的理解。

在不到十年的时间里，单细胞和空间多组学的研究见证了巨大的技术革命，为控制发育、生理和病理的细胞内和细胞间分子之间的相互作用机制提供了重要的新见解。在这篇综述中，作者强调了单细胞和空间多组学技术（也称为多模态组学方法）等快速发展领域的进展，以及跨这些分子层整合信息所需的计算策略。并展示了它们对基础细胞生物学和转化研究的影响，讨论了当前的挑战，并提供了对未来的展望。

人类和许多真核生物由数十亿细胞组成，细胞类型和功能细胞状态具有巨大的异质性。本质上，细胞内不同的“组学”层次具有复杂的交互式分子层次：从基因组和表观基因组到转录组，蛋白质组和代谢组，再反复。要研究多细胞生物如何从一个全能的单细胞发展而来，需要单细胞和空间多组学方法（也称为多模式组学方法）。

为了发展对单个细胞从基因组到表型的分子层次的基本理解，单细胞和空间分辨率的多组学方法是必要的。它们使在发育、衰老和疾病过程中，表观基因组水平上的基因调控和转录组和/或蛋白质组水平上的基因表达之间的分子间动力学研究变得明确。此外，这些技术能够研究单细胞基因组中获得性遗传变异对其自身功能和表型特征以及（周围）组织功能等的影响。近年来，这一领域在技术和计算上都取得了显著的进步和快速的成熟，使细胞生物学得到了广泛的应用。

单细胞和空间多模态方法的时间线

一、单细胞多组学方法

来自单个细胞的多组测量可以采用不同的方法，而这些方法可以根据不同的分子分析物在测序文库制备之前、过程中或之后是否解偶联进行分类。

从单个细胞中进行多组测量的一般原理。

1、单细胞基因组学+转录组学

第一组方法是在测序文库制备前对DNA和RNA进行物理分离（图2a）。另一组方法依赖于一种预扩增和分离的方法来解耦DNA和RNA分子分析物（图2c）。通过对同一细胞的基因组和转录组的研究，我们可以明确地研究获得性DNA突变对同一细胞中的基因表达的影响。这对于理解肿瘤内的异质性有重要的应用价值，可以研究不同的遗传亚克隆之间，甚至在单个遗传亚克隆中，不同表型癌细胞状态的发展。例如，DNTR-seq在儿童急性淋巴细胞白血病中发现了具有遗传拷贝数改变和相关转录干扰改变的小亚克隆。此外，它将允许研究这些基因亚克隆内的细胞如何应用细胞可塑性来改变它们的基因表达库，并适应不同的表型癌细胞状态，能够承受药物治疗，并最终获得耐药性。

除了肿瘤学领域之外，这些多组学方法对于包括神经系统疾病在内的其他疾病以及正常组织突变也有较大的研究意义，如研究获得突变的作用或其对表型和功能细胞状态的影响。单细胞基因组加转录组测序也是研究基因组编辑在种系治疗中的有效性和安全性的一个有价值的工具。如CRISPR-Cas9基因组编辑有潜力作为纠正致病突变的治疗工具。

基于标记的单细胞多组学分析方法

2、单细胞表观基因组学+转录组学

大多数已知的表观遗传信息层，包括DNA甲基化、染色质可及性、组蛋白修饰、转录因子（TFs）和染色质重塑复合物的结合，都可以从单个细胞中与转录组平行恢复。但这些方法在灵敏度、特异性和易用性方面都有限制。

在大多数方法中，转录组和可获得的染色质文库是在一个共同的反应中制备的，并在使用磁珠、限制性内切酶或特异性PCR引物进行索引后进行分离。转录组和染色质可及性的联合谱分析的一个关键优势是，基因表达和TF之间的联系更容易评估。这些动态系统中的多组学分析使TF很容易地与靶基因结合，这些方法的易用性引领了它们在生物医学和其他领域的应用。

然而，上述方法量化了开放染色质，但没有解决可及性变化的原因。为了解决这一限制，标记不再是随机针对可访问区域，而是针对特定的组蛋白PTMs或TFs。将转座酶结合到特定的抗体上，使转录组和表位的联合分析。细胞和模态条形码也可以通过DNA-RNA分离、预扩增和分裂、序列分裂或组合索引原则进行，转录组和DNA文库通过限制性内切酶、PCR或磁珠进行分离。

表观遗传信息也可以通过DNA甲基化谱来读取，依赖于5-甲基胞嘧啶（5mC）或n6-甲基腺嘌呤（6 mA）。在最基本的方法中，内源性5mC DNA甲基化通过单细胞的亚硫酸氢盐测序进行定量。

数据的多组学性质能够对细胞进行非常深入的分析，揭示在发育、分化或发病过程中表观基因组和转录组的变化层次。可及性和DNA甲基化的变化似乎是紧密协调的。这些研究表明，单细胞的转录组学和表观遗传层的多组学分析是可行的。

选择了基于DNA甲基化的单细胞多组学分析方法

3、单细胞组学加上另一种分析物的低重分析

最近在对单一分析物全面分析单细胞和不太全面（低倍）分析物方面取得了重大进展，最常见的是量化细胞的转录组和/或可及性的基因组，以及一组有限的细胞表面或核内蛋白质。这些方法通常依赖于标记有特定条形码寡核苷酸的抗体，这些抗体可以与转录组一起被捕获和扩增。

二、空间多组学方法

空间多组学技术被《自然》杂志列为2022年最值得关注的技术之一。样本的空间多组学可以单独应用于相邻的组织切片上，如果可以保持不同的分析物的质量，则可以连续应用于同一组织切片上；如果可以联合靶向并读取出不同的分析物，则可以平行应用于同一组织切片上。在不同的分子水平上可以同时分析的目标分析物的数量因方法而异。

1、通过相邻切片策略实现的空间多组学研究

在同一组织样本的相邻或连续切片上对所有感兴趣的单组学层进行空间分析，使这些技术能够得到最佳的检测设置并对数据进行计算集成（图5a），需要经过深思熟虑的实验设计和良好的分析协调。这种方法的缺点是存在样本异质性，即使是相邻的部分在结构和细胞组成上也略有不同，不同的空间检测可能有不同的分辨率。因此，能够在同一组织切片上进行空间多组学测量的创新方法已经开始出现。

空间多组学方法

2、空间（表观）基因组学+转录组学

空间ATAC&RNAseq和空间CUT&Tag-RNA-seq分别描述了在同一组织冷冻切片上同时进行染色质可及性或特异性组蛋白修饰和基因表达的无偏性分析的可能性。这些方法是基于结合空间-ATAC-seq或空间CUT&Tag的微流体确定性条形码组织（DBiT）策略与DBiT-seq多聚(A)转录谱相结合。

另外，通过使用激光捕获显微解剖（LCM）从组织切片中分离特异性（单）细胞，基于单细胞测序的基因组加转录组或表观基因组+转录组分析方法可以应用于空间分辨率，正如对三阴性乳腺癌患者的肿瘤发展、转移和预后所做的分析。

3、空间转录组学+蛋白质组学

允许对转录组和蛋白质组进行平行空间询问的方法目前仍然有限，通常基于这两种模式的序列表征，大多只允许对有限数量的蛋白质进行共同表征，而且往往缺乏单细胞分辨率。空间多组学显示空间转录组学与DNA条形码抗体和/或六种蛋白质的免疫荧光共映射兼容，并增加了使用液体处理机器人实现的全自动化概念，提高了通量和性能。

基于芯片的DBiT-seq方法也允许在组织冷冻切片中将poly（A）mRNA与蛋白质联合作图，迄今为止，空间-cite-seq方法是允许最多数量的蛋白质与多聚糖同时进行空间分析的方法，并有进一步扩展的潜力。

三、数据整合

多组学数据集成的一个主要目标是实现稳健和敏感的细胞类型或细胞状态识别。这种整合的多组学观点可以提高我们对分化轨迹、潜在的基因调控网络、细胞-细胞相互作用、微环境空间组织、细胞谱系和克隆动力学的理解。为了实现高维数据模式的有意义的集成，需要开发理解这些技术生物复杂性的计算和统计模型。

数据集成策略

1、连接分子层

当成对的数据模式可以明确地分配给单个单元格时，可以根据分析的最终目标应用几种集成策略。经典的GRN推理方法，仅使用scRNA-seq数据识别出一组富含特定上游调控基序的共表达基因。然而，这种方法容易产生假阳性基因关联。利用同时通过测序分析开放染色质和基因表达的方法可能优于仅从scRNA-seq推断GRN的方法。与局部方法相比，全球集成策略旨在识别更规模的模式（数百到数千个特征），以无监督的方式识别细胞状态的全局变化。为此，线性矩阵分解方法，如主成分分析（PCA）、典型相关分析（CCA）和非负矩阵分解（NMF）已被证明能够成功地识别细胞异质性的潜在因素。

2、空间多组学的数据集成

空间单组学和多组学技术也受益于各种数据集成策略。应用前垂直积分、水平积分算法可用于校正不同或相同样本不同部分之间的技术差异。对于不能实现单细胞分辨率的空间组学技术，反褶积方法可以用单细胞数据来识别一个特定组织区域的细胞成分。对非空间单细胞多组学数据进行垂直整合，然后使用RNA模式进行空间反褶积，可以对其他分子模式进行间接的空间映射。

3、当前在数据集成方面面临的挑战

在不同批次的水平数据集成的情况下，特别是在研究不同实验条件下细胞状态的细微变化时，可能导致真实生物变异的过度校正。当特征之间的对应关系不明显和/或不同层之间的非线性可能与生物学相关时，这个问题在垂直集成策略中进一步加剧。因此，需要开发集成方法，不仅可以识别不同样本和/或分子层之间的共同锚，而且可以用更有逻辑性的方式解释样本特异性和模式特异性。

文章最后，作者总结到，单细胞和空间分辨率的多组学是我们对细胞生物学的理解更加全面，并将在多个方面取得进展，包括提高通量、降低成本和在单一检测中加入更多的方法。

所有这些技术和计算的发展将有助于我们更好的理解生物功能和器官衰老，并将在解开疾病的细胞发病机制、识别更有效的分层策略的疾病过程，以及设计新的治疗模式和指导精确医学方面发挥更重要的作用。

教授介绍

Thierry Voet，现就职于鲁汶大学单细胞组学研究所、鲁汶大学人类遗传学系、美国联合帕金森病科学（ASAP）合作研究所。对单细胞和空间多组学相关研究做出了杰出的贡献。

参考文献

Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B.et al. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41576-023-00580-2