2020-11-24: 压力超负荷驱动的心衰小鼠免疫浸润的单细胞

论文信息

Title: Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload-Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation

Journal: Circulation

IF: 23.603

Publish date: 2019

Author: Martini, Elisa; Kunderfranco, Paolo

研究背景

炎症是心脏疾病的临床反应的重要组成之一，巨噬细胞和T淋巴细胞在心力衰竭的过程中发挥重要的作用。因此，通过调节免疫反应进而治疗心脏疾病成为了可能，但是心脏免疫细胞的活性却知之甚少，并且在压力超负载驱动下，心脏免疫细胞是如何变化的也是未知。

技术路线

• Pressure-overload transverse aortic constriction(TAC)的C57BL/6J小鼠模型，分别收集1和4周的TAC和Sham模型的CD45+(infiltration of immune cells)细胞用于单细胞转录组测序；

• 快速分离制备心脏CD45+的protocol以及设置duplicates增强分析可靠性；

• Seurat的graph based clustering算法聚类；

• Pearson correlation analysis分析聚类效果；

• 使用immune cell gene marker注释scRNA-seq的CD45+ cells；

• 堆积图展示免疫细胞簇丰度的ratio信息；

• fluorescence- activated cell sorting(FACS,荧光激活细胞分选办法)验证细胞簇biomarker；

• DESeq2识别差异基因；

• GSVA分析获取不同免疫细胞簇的pathway富集分数。

研究结果

1. 心脏组织拥有20类免疫细胞簇，这些细胞簇与疾病发展有密切相关关系。其中丰度前三的细胞群是macrophages/monocytes、B cells和Nature Killer cells。堆积图显示，免疫细胞簇的丰度随着疾病发展发生了变化，这说明心脏毒性免疫反应和多种免疫细胞相关，最后在整体上表现出炎症反应。

2. 根据CCR2的出现+或缺失-定义心脏巨噬细胞，定居()和游走()macrophage/monocytes。前者负责清除细菌及外来异物，后者负责招募促炎(proinflammatory)的macrophage/monocytes。Cluster 3富集，而Cluster 4 5 8则富集。进一步分析发现，cluster 3还特异表达与免疫相关的Cd163和Mrc1主要组织相容复合体II(major histocompatibility complex: MHC)。另外，cluster 4和8可能是骨髓来源的macrophage/monocytes，它们表达了促炎症因子oncostatin M (Osm)，该基因的过表达促进心脏器官功能障碍。

3. Sham和TAC组心脏均有大量B cells，根据四组B cells簇在疾病前后的丰度变化，发现cluster 2 11收到压力后激活。

4. 和(更重要)T细胞均在心衰心脏组织出现，flow cytometry验证了两类T细胞的整体丰度类似。unsupervised Reactome signature analysis 揭示 cluster 13 15与T cell receptor signaling pathways显著相关。

5. 整合所有免疫细胞的全局分析揭示 TAC和Sham的差异基因表达在疾病发展过程也是动态变化的，第一周和第四周 ll1b等促炎因子基因显著富集在疾病组，在第四周则出现了Ccr2和Cd68等新的促炎因子基因。最后在综合所有TAC和Sham分析，仍然发现类似的现象。

学习心得

1. 单细胞注释：准确地注释cell type对后续分析至关重要，文章结合marker gene 和簇相关对簇注释和合并；

2. 簇内进行子分类，每个分类的功能以及marker gene可以进一步解析；功能注释文章用到了unsupervised Reactome signature analysis；

3. 纵向数据可通过整体簇丰度变化阐明处理对基因的影响；

4. GSVA方法对功能富集分析有较大的帮助；

5. 生物学知识要相当丰富，文章针对是心衰的免疫解析，各类免疫细胞的属性要有详细的了解。TAC后 nature killer cell会增多。

问题和改进

1. 堆积图面积的变化是否能够真正说明免疫细胞丰度发生显著变化呢，并且这种变化是否具有临床学的意义呢？文章使用了drastic changes词语描述是否合适？

2. 文章提供的数据存在不严谨标记，TAC 1和4周应该是不同的样本，但它给出的标签是repA 和repB；

Citations

1. Martini, Elisa, et al. "Single-Cell Sequencing of Mouse Heart Immune Infiltrate in Pressure Overload–Driven Heart Failure Reveals Extent of Immune Activation." Circulation 140.25 (2019): 2089-2107.