最近一直在学习植物再生能力方面的知识。今天分享一篇2020年发表在science上的一篇文章，根据报道，题目是《Cell-cell adhesion in plant grafting is facilitated by b-1,4-glucanases》。该研究论文指出，研究人员通过实验发现烟草能够充当非近缘物种之间进行嫁接的“媒人”，同时发现了烟草嫁接成功率高的原因。

Cell-cell adhesion in plant grafting is facilitated by β-1,4-glucanases

嫁接是常见的一种无性繁殖技术，即通过将一种植物的接穗（scion）与另一种植物的砧木（stock）相结合，通过伤口愈合的过程使两种植物的形成层紧密结合并最终成活为单个植物。嫁接被广泛应用与果树和蔬菜繁殖中，以提高果蔬的抗病抗逆能力并保留优良品质。值得注意的是，由于嫁接亲和性的限制，同种植物之间的嫁接最易成功而亲缘关系较远的植物之间实现嫁接的可能性较小。而有研究发现，不同种植物也具有不同嫁接的潜力。但是，到底是什么影响了嫁接的成功率尚不清楚。

========实验结果========

首先，作者先测试了不同属之间植物的嫁接兼容性。然后发现烟草可以与比较远的物种成功嫁接，不同属之间的嫁接可以存活一个月以上的时间（Table S1，附图3）。

Table S1 附图3

在初步实验中，研究人员设置了三组对照实验，第一组的嫁接实验在同种类菊花之间展开（Cm/Cm）（图1A），第二组嫁接实验在本氏烟草和同种类的菊花之间展开（Cm/Nb）(图1C)，第三组嫁接实验在大豆和同种菊花之间展开（Gm/Cm）（图1B）。三个月过去之后，研究人员发现本氏烟草的嫁接实验成功了，因为菊花上长出了本氏烟草。在嫁接连接的地方，在嫁接不成功的组合Gm/Cm边界处发现了坏死层（图1D-1F）。坏死层的形成是嫁接过程中细胞与细胞不相融的标志。而Nb/Cm嫁接则显示细胞与细胞粘附成功。嫁接不成功的Gm/Cm则出现了由嫁接损伤引起的细胞壁折叠（图1G），但是成功的Nb/At则在嫁接出形成了薄的细胞壁（图1H-1K）。因此，Nb可以在跨属的嫁接之间实现细胞与细胞的黏连，从而达到成功嫁接的目的。或者，我换种想法，是不是也是再生能力比较强，并且这种能力可以打破不同属之间的壁垒。

图1

为了研究烟草能够成功进行不同属之间嫁接的分子机制，作者在嫁接后的2小时到28天分析了Nb/At嫁接处的转录表达情况（图2）。转录水平在嫁接之后2个小时内发生了明显的变化，并且随着时间的推移进一步变化（图2A，2B）。与嫁接相关的基因，在Nb/At嫁接后上调，包括与生长素响应，创伤修复，形成层以及维管束发育相关（图2B）。这些基因的表达和Nb/Nb嫁接相比，水平差不多level，甚至还高（图2C）。嫁接植物连接处的转录变化与形态上的变化是一致的：在嫁接处观察到了增值细胞和木质部的形成，只不过木质部比较薄（图S4A-S4E）。染色实验发现在嫁接后大概3天后发现了质外和同质转运（图S4F-S4H）。并且还检测到了mRNA和绿色荧光蛋白通过嫁接植物的转运，但是低于同种植物的嫁接（图S4I-S4J）。因此，Nb接穗的活力通过在嫁接处形成实体的组织成功生长。

为了阐述嫁接背后的分子机制，我们在Nb/At嫁接的Nb接穗处鉴定到了189个早期上调的基因（图2D）。这些基因的GO富集分析结果表明主要和细胞外区域，细胞壁，质外体等功能有关（图2E），也说明了烟草的细胞壁经过了调控和修饰。其中编码细胞壁修饰的酶包括：β-1,4-葡聚糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、木葡聚糖水解酶和膨胀素，在嫁接后显著上调（图2F）。Nb/At嫁接植物连接的激光显微切割样品证实了这些基因表达的增强（图2G和2H）。属间嫁接和机械损伤的转录组结果也表明细胞壁相关基因的转录变化。因此，烟草激活了属内和属间嫁接过程中的细胞壁重建。

图2 附图4

为了比较属间嫁接的转录变化，作者鉴定了在Nb/At嫁接中Nb接穗上上调的基因,但是在Gm/At嫁接中Gm接穗中并不上调【作者是从Gm中选取的与Nb中相似度最高的homolog】。在Nb接穗中上调的189个基因中（图2D），Gm接穗中只有110个同源基因上调（图3A）。因此,作者接下来进一步分析了这79个基因,GO富集结果表明与细胞外区域和细胞壁相关的基因比例过高（图3B）（与图2E相比，与细胞外区和细胞壁有关的基因数量为14个中的9个，而与其他GO术语相关的基因数量则为50个中的16个）。

通过比较家族间移植转录组，我们鉴定了在Nb/At家族间移植的Nb接穗中上调的基因，但在Gm/At家族间移植物的大豆（Gm）接穗中不上调的基因。我们从Gm中选择了与每个上调的Nb基因显示出最高同源性的基因。在Nb接穗中上调的189个基因中（图2D），Gm接穗中只有110个同源基因上调（图3A和补充材料）。我们进一步分析了在Nb而不是Gm接穗中上调的79个同源基因。在79个基因中，与细胞外区域和细胞壁相关的基因比例也过高（图3B）（与图2E相比，与细胞外区和细胞壁有关的基因数量为14个中的9个）。这一结果也再次说明，成功的烟草属间嫁接需要细胞壁重建。

在Nb属间嫁接植物上表达的一个基因是NbGH9B3，它编码糖基水解酶9B（GH9B）家族的β-1,4-葡聚糖酶。NbGH9B3的表达在1 天时上调，在3 天时进一步升高，但在Gm/At属间嫁接中Gm同源物的表达不显著（图3C）。GH9B家族的β-1,4-葡聚糖酶在植物生长过程（如根系伸长）中的纤维素消化和细胞壁松弛或构建中发挥作用。因此，作者推断NbGH9B3可能促进了嫁接植物边界处细胞与细胞之间的粘附。因此，作者接下来进一步分析了NbGH9B 3在嫁接植物中的功能。

图3

作者利用VIGS来测试NbGH9B3在Nb/At属间嫁接过程中的功能（图3D-3F）。NbGH9B3沉默后导致在嫁接两周后失败，Nb接穗从At中分离,并且在嫁接处i改昵称了坏死层（图3D）。NbGH9B3的表达量反映了嫁接的失败（图3E和3F）。在嫁接的连接处看到折叠的细胞壁,通常是嫁接失败的特征.当NbGH9B3被沉默后,在嫁接处观察到了折叠的细胞壁,但是对照中则没有（图3G-3J）。对于NbGH9B3的编辑材料，作者发现与At的嫁接中,野生型是91%,而编辑材料是60%（图3K）。因此，NbGH9B3编码的β-1,4-葡聚糖酶促进了烟草属间嫁接的建立。

图3

接下来，作者开始研究β-1,4-葡聚糖酶是否也在其他属的科内嫁接中发挥作用（图4A和4B），包括大豆（Gm）、牵牛花（in）、玉米（Zm）和拟南芥（At）。在Gm、In和At同源植物嫁接中，一个GH9家族基因在7天内上调；均属于GH9B3分支（图4A和4B）。对于At为砧木，Gm和In接穗中，GH9B3在1天后上调，其余时间不变化（图4B）。Zm在嫁接过程中失败，因为单子叶职业缺乏形成层的形成。在Zm嫁接的植物中，GH9B3的同源基因均不发生变化。

为了探索GH9B3在其他植物属的嫁接中的作用，作者又选取了拟南芥中这个基因的两个突变体（图4C）。然而，与野生型相比，两个突变系植物在嫁接后成功率没有变化，但是发芽率都有所下降（图4C）。因此，GH9B3不需要在At中建立嫁接植物连接，但确实有助于嫁接后的芽生长。为了检测GH9B3过表达对嫁接的影响，作者在拟南芥中过表达了NbGH9B3，然后发现过表达后移栽成功率显著高于野生型（图4D）。因此GH9B3在烟草和拟南芥的嫁接过程中同样都起作用。

作者研究结果表明，烟草的这种嫁接能力需要在属间嫁接时才能被激活。为了利用这种能力，作者探索了烟草是否可以作为不同植物的嫁接中间体。作者使用烟草作为At/Cm和番茄的中间嫁接体。结果表明，可以成功实现番茄和At/Cm的嫁接（图4E-4G），当然作者也测试了其它的砧木和接穗。

图4