生物学基本理论：细胞内主要成分是水，因此水分的形态结构变化对生物样本的活性有很大的影响。随温度降低，水会由六角形冰晶逐步变为对细胞膜和细胞器没有太大损伤的玻璃化态。
冷冻生物样本时，在细胞中会发生如下过程：
当温度在0℃~10℃时，细胞仅维持了一个被减慢的细胞代谢过程但信号传导已经完全停止；
当温度在-15℃~-2℃时，细胞外的冰晶形成使细胞开始脱水；
当温度在-25℃~-15℃时，细胞内的冰晶形成，细胞质因此发生分离；
当温度在-130℃~-25℃时，冰晶开始迁徙生长；
最后，从< -130℃起，细胞以固态存在且很长一段时间没有大的变化。
固体是指自由液态水将不复存在，水分子仅以结合水、冰晶、或玻璃化的状态存在。
这里的“很长一段时”，举个例子，在-100℃需要1秒时间完成的生化过程，在-128℃下需要51秒，在-196℃下需要2767年（依据Arrhenius Equation的生化反应进程与温度的关系理论）。
渗透性冷冻保护液主要包括甘油、丙二醇、DMSO等，会同溶液中水分子以氢键结合，发生水合作用，使溶液的粘性增加弱化水的结晶过程，从而减少冰晶的形成。浓度越大抑制力越强，保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。
如何使细胞降温至-130℃以下？
1、传统冷冻：4℃10min→ -20℃ 30min→ -80℃过夜→ -196℃长期存储，适用细胞株等非脆弱细胞
2、直接放入液氮：适用含水量低的细胞，如红细胞
3、玻璃化冷冻：冷冻液中平衡5~10min，装入载杆，立即插入液氮，复苏率非常高，适用大体积细胞，如胚胎
4、程序冷冻：液氮降温盒，程序降温仪，适合冻存数量大、对温度数据有要求的实验室
为什么使用程序冷冻仪？
1、不同阶段最适的降温速率
用于提取大分子的血液/尿液或组织等样本，只要有适合等温度就可以长时间安全储存；但对于活细胞来说，不仅要有合适但存储温度，还要有合适的降温过程。
降温速率过快，细胞内水分子来不及渗透到细胞外，形成胞内冰，刺破细胞膜，使细胞不完整；
降温速率过慢，由于细胞膜外的渗透压高于细胞膜内 ，造成细胞充分脱水，细胞内盐浓度过高，使胞内蛋白质变性、细胞器损伤。
因此，活细胞在存储前有一个适合的降温过程非常重要，先以适合的降温速率降温，让细胞脱水至一定程度后再迅速放入液氮中，温度急剧变化使细胞内冰晶来不及形成或向外扩大生长时形成玻璃化状态，不损伤细胞膜。即“先慢冻，后快冻”
2、找出变相点，避免或迅速度过回温阶段
目前主流的程序冷冻仪是利用液氮降温，在控制器上预先设定冷冻程序，温度传感器测量冷冻室温度，电磁阀控制调节液氮流量。
程序冷冻仪以外界液氮为制冷源，控制器按预先设定的程序运行，在不同温度区间执行不同的降温速率，通过低温电磁阀的调节，使适量的液氮经传输软管送至氮气入口，经风扇及风流隔板均匀吹向冷冻室内为样本降温，最终达到存储温度。
当细胞膜外开始形成冰晶时，即液态开始变成固态时会释放出潜伏热，此时，可以通过增加液氮输出量带走这部分潜伏热，防止样本温度回升形成大的冰晶，减轻对细胞的损伤。
不同样本（冷冻保护液的种类或浓度）的冻结起始点不同，主要取决于结晶核的数目。
3、箱体容量大，可冷冻的样本数量大、类型多
Planer Kryo 560程序冷冻仪的容量是16L，一次可冷冻784支2ml样本管或22袋50ml血袋/细胞袋，可消除因数量少而造成的样本批次间差异。
4、冷冻曲线可被实时记录，便于追溯
程序冷冻仪可以实时记录生物样本的温度曲线，并可保存，必要时还可以连接打印机将温度曲线打印出来。
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