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RNA-seq(一) rawdata分析

RNA-seq(一) rawdata分析

作者: 木夕月 | 来源:发表于2022-03-17 16:47 被阅读0次

    酵母(Saccharomyces cerevisiae )细胞,单条线性染色体的RNA-seq数据分析

    1 prefetch下载数据

    使用:把sratoolkit.2.10.8/bin加入环境变量使用相对路径;调用prefetch的绝对路径。
    如果数据过大,可加参数--max-size 100G

    vim download_data.sh
    #!/bin/bash
    for i in `seq 4 1 9`
    do
      prefetch-orig.2.10.8 `srapath-orig.2.10.8 SRR705970${i}`
    done
    #for循环,下载6个数据
    qsub -N download -cwd download_data.sh -q g5.q 
    #-N:提交的任务名,-cwd:在当前路径下提交,日志会输出在当前目录下;-q :指定提交的队列;-o:重定向标准输出;-e:重定向标准错误信息输出(不设置-e,-o会生成提交任务id的.o和.e文件)
    

    vi文本编译器,vim 是 vi 的增强版(vi Improved),与 vi 编辑器完全兼容,而且实现了很多增强功能。详细介绍:Linux vi/vim | 菜鸟教程 (runoob.com)
    不要直接在服务器终端跑大型命令,把命令提交给服务器
    qsub命令:用来从登录节点上向计算节点进行任务投递。SGE(SGE, Sun Grid Engine)集群管理工具可以用来提交批处理作业,SGE支持单或多节点作业,它将用户投递的任务进行排队,然后将任务交给能够运行的结算节点执行,工作流程可以分为四步:接受用户提交的任务任务运行前将任务放到一个存储区域发送任务到一个执行设备,并监控任务的运行运行结束写出结果并记录运行日志
    qstat:可查看提交任务的运行状态,"r"代表任务正在执行;"qw"代表任务在等待执行,一旦有计算资源了会马上运行;Eqw,投递任务出错;
    qdel:删除提交的任务;qdel+ job_id

    2 fastq-dump 格式转换

    fastq-dump是sratoolkit.2.10.8的子工具,我们需要把下载的数据sra格式转换为fastq格式。
    FASTQ格式是将核酸序列其测序质量得分信息合并在一起的文本格式。质量得分是指该碱基的错误概率的对数值。
    在FASTQ文件中,一个序列通常由四行组成:
    第一行:@开头,后面是序列描述信息(与FASTA格式的描述行类似)
    第二行:序列信息
    第三行:+开头,后面是序列描述信息
    第四行:碱基质量得分,与第二行的序列相对应,长度也与第二行相同
    Sequence Read Archive (SRA)数据库,用于储存来自不同高通量测序平台的原始序列数据和比对信息。在提交测序数据到SRA数据库时,每一个样本会获得一个以SRR开头的数字编号:SRRxxx,数据格式为 .sra 。
    生物信息学常见数据格式汇总(https://zhuanlan.zhihu.com/p/67402565)

    vim sra2fastq.sh
    #!/bin/bash
    for i in `seq 4 1 9`
    do
      fastq-dump-orig.2.10.8 --split-3 -O fastq --gzip SRR705970${i}/SRR705970${i}.sra
    done
    qsub -N fastq -cwd sra2fastq.sh
    

    --split-3:将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads会单独放在一个文件夹里;(懒人做法,无论单端还是双端的SRA文件,都可加--split-3)。
    --gzip:输出gz格式,,节省空间。

    3 fastqc质控

    vim fastqc.sh
    #!bin/bash
    for i in `seq 4 1 9`
    do
      fastqc SRR705970${i}_1.fastq.gz SRR705970${i}_2.fastq.gz
    done
    qsub -N  fastqc  -cwd fastqc.sh
    

    评价所获得的数据能不能用,这一步就叫做质量控制(Quality Control, QC)。详细讲解:RNASeq原始数据质量控制-FastQC - 知乎 (zhihu.com)

    multiqc *fastqc.zip
    

    multiqc 可整合QC质控结果,快速查看结果

    4 trim_galore 过滤

    可参阅Babraham Bioinformatics - Trim Galore!

    vim trim_galore.sh
    #!bin/bash
    for i in `seq 4 1 9`
    do
      trim_galore --output_dir clean_data -q 25 --phred33 --length 36 --paired SRR705970${i}_1.fastq.gz SRR705970${i}_2.fastq.gz
    done
    qsub -N trim_galore   -cwd trim_galore.sh
    

    --length:设定输出reads长度阈值,小于设定值会被抛弃。
    -q 25:低质量区域,若碱基质量值<25,后面的碱基被cut
    Overview of removed sequences 记录、统计去掉的reads
    --paired 如果序列对中的一个(或两个)小于设置的长度截断值,则移除整个序列对。 removes entire sequence pairs if one (or both) of the two reads became shorter than the set length cutoff.

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