《陈巍学基因》笔记(32)用 CRISPR 找新肿瘤药

本期笔记将基于 High-Resolution CRISPR Screens Reveal FitnessGenes and Genotype-Specific Cancer Liabilities^[1] 为大家介绍

「如何用 CRISPR 方法寻找可能的肿瘤药物~」

「目 录」

• 核心内容

• CRISPR-Cas9
  应用

• 实验方法
  文库设计
  实验预期

• 细胞系

• 实验结果
  保健基因

• 潜在肿瘤药物
  DLD1
  FDFR1
  IGF1R

• 电子传递链复合物 1

• 尾巴

第 32 期原视频

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核心内容

1. 通过 CRISPR 方法，分别敲除几种肿瘤细胞系的几乎所有的基因。

2. 用高通量测序，看哪些基因被敲除后，细胞的生长会受到抑制。

3. 在几种肿瘤细胞系之间进行比较，看哪个基因，对一个特定细胞系的生长，是必需的，而在别的细胞系中，是非必需的。而这个基因就可能是治疗这种肿瘤的潜在治疗靶点。

CRISPR-Cas9

CRISPR 现象最早发现于细菌中，细菌用其保护自己免受病毒的感染：

1. 当细菌发现存在病毒 DNA 时，会制造出两种短的 RNA。其中一段含有与入侵的病毒相匹配的序列称为指导 RNA(guide RNA, gRNA)。

2. 两段 RNA 与 Cas-9 核酸酶形成复合物。

   当指导 RNA 的匹配 RNA，在病毒基因当中找到目标序列的时候，Cas-9 就能切断该段目标 DNA，从而使病毒失活。

3. 一旦 Cas-9 复合物进入细胞核，它就会形成一个套索结构。

   Cas-9 会把 DNA 双链打开，并且把它匹配到指导 RNA 上。匹配完之后，Cas-9 会用 2 个很小的分子剪刀，切断 DNA。当切断发生，细胞会尝试修复断点，但是在修复过程中，很可能会引入错误，导致基因失活。

应用

研究人员认识到，它不仅可以切断病毒的 DNA，还可以在精确选定的位置，切断任意的 DNA 序列。现在，我们不仅可以在试管当中切断目标 DNA，还可以在活的培养细胞当中，切断目标 DNA。

而且通过让基因失活，就达到了基因敲除(Knock Out)的目的。研究人员就可以用这个方法，来研究基因的功能。

实验方法

1. 设计敲除文库序列。也就是针对每一个要敲除的目标基因，根据其外显子来设计敲除序列。

2. 用芯片合成法，高通量地合成序列文库。

3. 对这些序列文库进行 PCR 扩增，得到拷贝数倍增的 PCR 扩增库。

4. 把扩增库连接到 pLCKO 质粒载体当中。

5. 把质粒转化进大肠杆菌中，进行扩增。扩增后的质粒库，是含有多种文库序列的混合质粒库。

   pLCKO 载体有嘌呤霉素的抗性基因，未来可以用于对被转化的肿瘤细胞进行抗性筛选。

   [图片上传中...(image-cad982-1594616480268-0)]

   同时 pLCKO 载体上有慢病毒包装蛋白的结合序列，未来可以与慢病毒包装蛋白相结合，包装成能够感染细胞的慢病毒颗粒。

6. 用慢病毒蛋白对这些质粒文库进行包装。包装好之后，就得到了有感染性的病毒颗粒。
7. 用包装好的慢病毒颗粒去转染目标细胞。
8. 被转染后的目标细胞，用嘌呤霉素进行筛选。能够活下来的细胞，就是有嘌呤霉素抗性的、被转染成功的细胞，同时它里面也会含有 gRNA 的序列。
9. 将筛选后的细胞，分成若干个培养瓶进行培养。

10. 每三天，取一批细胞，抽提基因组 DNA。每一批，至少是三个生物学重复。

11. 对抽提出的基因组 DNA，用针对 gRNA 序列的引物，进行 PCR 扩增，把细胞中的 gRNA 序列扩增出来。

12. 对扩增出来 gRNA 进行高通量测序并进行生物信息学的分析。

文库设计

实验设计有两套文库：

1. 对序列的限制条件比较严格的文库，目的是可以减少脱靶敲除的发生。但是，因为对序列的限制条件较严格，所以得到的序列数较少。

   最后得到一个针对 17 232 个基因，有 91 320 条 gRNA 序列的一个库，被称为是「90K 文库」，因为有 9 万多个 gRNA 序列。

2. 其设计的 gRNA 最后四个碱基不含 U。因为如果最后四个碱基含 U 将大幅降低敲除效率。

3. 排除 GC 比例低于 45%或高于 70%的序列。

4. 在引导区和它旁边的间隔区的序列（guide-plus-PAM 区域），如果允许 2 个碱基的错配的话，在基因组上，只能有目标基因这一个基因与指导序列相匹配，不会有其它的基因与指导序列相匹配。这样设计，是为了尽量减少脱靶敲除即意外地敲除非目标基因。

5. 一个基因最多设计 6 个 gRNA 序列。

6. 放宽限制的文库，用以覆盖更多的基因。

   最后，他得到了一个针对 17 661 个基因，有 176 500 个 gRNA 序列的文库，称为「TKO 文库」(Toronto KnockOut library)，因为这项工作是在 Toronto 做的。

7. 在碱基错配的容错度上，放宽到容许 1 个碱基错配。

8. 对一个基因设计的 gRNA 序列数的上限，从前面的 6 个，放宽到 12 个。

实验预期

实验预期针对保健基因的 gRNA 量会下降，而针对非保健基因的 gRNA 量会不变。

原因是，如果一个细胞的保健基因被敲除，接下来这个细胞的生长繁殖都会受到影响，甚至会直接死亡。那么寄居在其中的 gRNA 量，也会随着细胞数的下降而下降。

反之，如果敲除掉的基因是非保健基因，这些细胞照常生长，寄居在其中的 gRNA 量也不会改变。

细胞系

在这篇文章当中，一共用了 6 种肿瘤细胞系进行实验。

1. GBM 细胞，人神经胶质母细胞瘤细胞。

2. RPE1，视网膜上皮细胞瘤细胞。

3. HCT116 细胞，人结肠肉瘤细胞。

4. DLD1（细胞），也是人结肠肉瘤细胞。

5. Hela 细胞，人宫颈癌细胞系。

6. A375 细胞，人的黑色素瘤细胞，也就是皮肤癌细胞。

一共是 5 种组织来源，共 6 种肿瘤细胞系。

实验结果

保健基因

论文作者 Traver 根据基因对细胞生长的必要性，做了一个雏菊模型。

首先，定义「保健基因」(Fitness genes)，当这个基因失去活性的时候，细胞的生长繁殖就会受到伤害。图中一种组织活细胞所有的保健基因组成一个椭圆，多种组织的多个椭圆交叉在一起，就形成雏菊样的图案。

雏菊的核心，是各种细胞生长都需要的、共有的基因，称为「核心保健基因」(Core fitness genes)。任何组织，只要少了这个基因，其生长繁殖都会受到伤害。

而椭圆间不交叉的基因称为「条件保健基因」(context-specific fitness genes)，在一种特定的遗传背景或者特定的周围环境条件下，缺失这种基因的功能，会导致细胞的死亡或不生长，也是本研究中，让研究人员最关心的基因。因为抑制这些基因的活性，就有可能杀死或抑制肿瘤细胞，同时又不影响别的正常细胞生存和增殖。

核心保健基因 GO 分析

文章将被三种或三种以上的细胞系共享的保健基因称为核心保健基因，共找到 1580 个。

进行 GO 分析可以发现：

1. 它们大量集中在转录、翻译、DNA 复制、DNA 修复方面。而且，集中度比别的功能高 4 倍以上。

   与核心保健基因相反的是，在细胞与细胞之间的信号交流、器官发育、细胞粘附方面的基因，在 GO 分析的结果当中，集中度比普通基因要少 4 倍以上。

   🔎

   按照陈巍老师个人见解，一种细胞之所以变成肿瘤细胞，是因为它对旁边的细胞不管不顾，只管自己的生长，这样的细胞就成了肿瘤。所以，在肿瘤细胞中，往往是负责细胞与外界沟通的那些基因出了问题。

潜在肿瘤药物

这篇文章中，找到了哪些未来有可能用药物治疗肿瘤的新途径？

DLD1

有 KRAS G13D 突变的肿瘤细胞 DLD1，对 EGFR 抑制剂敏感

KRAS 处于细胞生长调控的一个较为核心的位置，是一个开关，通过磷酸化、或去磷酸化，而被活化、或者去活化。但是，如果 KRAS 的第 13 位的甘氨基酸残基被突变成天冬氨酸残基（G13D 突变），则 KRAS 就变成一个持续活化的状态。

一般认为，EGFR 要激活下游的细胞增殖信息途径，要先经过 SHC/GRB2/SOS 等中间环节，然后活化 KRAS，再由 KRAS 激活下游信号路径。而如果 KRAS 已经变成一个持续活化的状态，则无论上游的 EGFR 是否打开，KRAS 都不会关闭。

也是基于这样的认识，目前在临床上，那些作用机理为 EGFR 抑制剂的肿瘤药物，例如：厄洛替尼(erlotinib)，在用药之前，一般先要测一下 KRAS 的第 12 号和第 13 号氨基酸是否有突变。如果发现 KRAS 的第 12 号或第 13 号氨基酸有活化突变，那么就认为：EGFR 抑制剂类的药物对这种肿瘤无效。

但是现在，广谱的 CRISPR 的敲除实验，给出了不同的实验结果：

有 KRAS G13D 突变的肿瘤细胞 DLD1，不仅对 EGFR 敏感，对 EGFR 传递信号到 KRAS 过程中，经过的 SHC1、GRB2 和 SOS1 也都很敏感。由通路图可以看出这些基因都是从从 EGFR 到 KRAS 的信号通路的中间环节。

再进一步的实验，用 EGFR 的抑制剂 erlotinib，来处理这 6 个细胞系。发现，DLD1 细胞系对 erlotinib 特别敏感；而别的细胞系，对 erlobinit 不敏感。

[图片上传中...(image-ae1f68-1594616480270-14)]

也就是说，erlobinit 可以选择性地抑制 DLD1 细胞的生长，而对别的细胞没有或很少的抑制作用。

🔎

有选择地抑制肿瘤细胞，同时对别的细胞的生长没有影响，正是寻找治疗肿瘤药物的首要标准。

此外，HCT116，它同样也有 KRASG13D 突变，这个细胞系就对 EGFR 的敲除不敏感。

用 erlotinib 来处理 HCT116 细胞系，发现 HCT116 细胞，对 erlotinib 不敏感，照长不误（这与 EGFR 敲除结果相一致）。

[图片上传中...(image-b7a353-1594616480270-13)]

也就是说，以前理论上认为，那些 KRAS 有活化突变的肿瘤。一般都是对 EGFR 抑制剂耐药的。

那么现在看来，未必是这样。如果能够用某种技术手段，例如：通过体外培养细胞的基因敲除方法，来搞清楚肿瘤细胞对 EGFR 活性的依赖性，那么 EGFR 抑制剂，还是可以适用于部分 KRAS 有活化突变的肿瘤的。

线粒体活性抑制

经过 GO 分析，发现 DLD1 细胞合成线粒体蛋白质的基因有高度的富集。

化合物 linezolid 和氯霉素，都是已知的细菌核糖体功能抑制剂。

用 Linezolid 处理，DLD1 细胞系的生长被明显抑制，而别的细胞几乎不受影响；

用氯霉素处理，DLD1 细胞系的生长被明显抑制，而别的细胞受影响较少。

从生物演化的角度来说，真核生物获得线粒体的内共生学说：

1. 真核细胞驯化了一个原核细胞，也就是细菌

2. 并把这个原核细胞，圈养在真核细胞的细胞胞内

3. 逐步强化这个原核生物的有氧代谢、生产 ATP（能量单位）的能力

4. 同时，逐步让这个原核细胞放弃了它原来的其它功能

5. 这个原核细胞，就渐渐地变成了我们目前看到的线粒体

所以线粒体当中的基因有许多原核细胞的特点，也就是有细菌的特点；Linezolid 和氯霉素都能够抑制细菌的蛋白质合成。所以，它们也就有可能抑制线粒体的蛋白质合成过程。

FDFR1

在 Hela 细胞当中，FGFR1(fibroblast growth receptor 1)，即成纤维细胞生长受体 1，是一个保健基因。

而化合物 PD173074 是辉瑞公司研发的一个化合物，已知它是 FGFR1 的强抑制剂。

用 PD173074 来处理这几种细胞，可以发现 Hela 细胞的生长被明显抑制，而别的细胞被抑制得较少。

IGF1R

经过核心基因分析，发现 IGF1R(insulin-like growth factor 1 Receptor)，即胰岛素样生长因子 1 受体是 Hela 细胞和 A375 的保健基因，不是 HCT116 细胞的保健基因。

用人工合成的抗 IGF1R 抗体，来阻断 IGF 对 IGF1R 的激活作用，会降低 Hela 细胞和 A375 细胞的生存能力，而对 HCT116 细胞没有影响。

电子传递链复合物 1

在 HCT116 细胞中，GO 分析发现它对线粒体活性有高度的依赖，组成电子传递链复合物 1 的蛋白，在其 GO 分析中，被明显富集。

鱼藤酮(rotenone)是一种细胞电子传递链抑制剂。

线粒体获得能量的主要方式，就是通过电子传递链获得能量，接下来的实验，证明：用鱼藤酮处理，对 HCT116 细胞的生长有明显的抑制作用，而鱼藤酮对别的细胞系的抑制较少。

二甲双胍(Metformin)是氧化磷酸化的抑制剂。

用二甲双胍来处理这些细胞，可以发现对 HCT116 细胞的生长有明显的抑制作用，而对别的细胞系抑制较少。

尾巴

本文的方法是在细胞水平广谱地敲除基因，并进一步地通过高通量测序、和生物信息分析的手段，找到可能的肿瘤治疗途径和治疗药物。

进一步联想出去，如果能够把培养细胞系改到培养原代细胞，并且加快实验当中各步骤的速度，把整个实验缩短到一个月、甚至半个月的时间，那么这个 CRISPR 广谱敲除的方法，还有可能成精准医学一个新的个体化诊断方法，并且会极大地拓展药物的可选范围。

References

[1]

Hart, T., Chandrashekhar, M., Aregger, M., Steinhart, Z., Brown, K. R., MacLeod, G., … Moffat, J. (2015).High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell, 163(6), 1515–1526.:doi:10.1016/j.cell.2015.11.015