陈巍学基因视频学习笔记--视频7：RNA-seq方法和应用

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陈巍学基因视频学习笔记--视频1：Illumina测序化学原理

RNA-seq的应用

1. 检测所有mRNA的表达量的差异；
2. 检测RNA结构差异：可变剪接、融合基因、基因但点突变导致的SNP

第一部分：RNA-seq测序方法

1. 去除核糖体RNA（由于rRNA非常保守，极度稳定，提供不了有用的信息）

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illumia公司的Truseq RNA建库方法

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Ploy A尾mRNA和PolyT探针结合，回收磁珠，将mRNA从磁珠洗脱后用镁离子溶液打断；被打断的片段用随机引物进行逆转录成cDNA，再合称为双链cDNA，在双链cDNA两端接上Y型接头

2. 对mRNA的完整度要求较高

由于PolyT探针只能结合PolyA尾，如果mRNA发生断裂（不完整），那么PolyT脱下来的PloyA mRNA则不完整，造成测序数据的偏差。

因此在测序前需要对总RNA的质量进行质检

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28S，18S峰越高越尖越好
RIN：RNA integrity number，0-10分，RIN在8.0以上是illumia公司推荐的标准。

第二部分：RNA-seq测序数据分析

1. RNA mapping到基因组上
2. RNA完整度
   下图显示mRNA的完整度

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3. RNA表达量分析：RPKM等等

   
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   某基因被测到的read数除以全部可比对到基因组上的read数 （容易理解）
   为什么还要除以外显子长度？
   因为外显子越长，被镁离子打断出来的片段就越多，因此需要修正mRNA长度引起的read的偏差。

4. 火山图等整体差异分析结果

5. 聚类分析

6. GO分析
   Gene Ontology：基因功能分类体系
   GO：参与的生物学过程；基因产物的功能；基因产物在细胞中的空间定位。

   
   
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7. KEGG京东基因和基因组百科全书
   不详细介绍图怎么看。

   
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8. RNA结构变异
   （1）可变剪接：建议测序深度较深，10G以上（二代测序测长不够长，是零碎状态）

（2）融合基因

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（3）点突变造成的SNP

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陈巍学基因的这系列视频是在2015年上架到youtube的，现在已经是2020年，很多数据分析的图表已经变得非常漂亮了一些处理方法也发生了改变，比如RPKM现在大家喜欢用TPM了，但是这不影响我们学习和补充一些基础概念和背景知识。