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陈巍学基因视频学习笔记--视频1：Illumina测序化学原理
RNA-seq的应用
- 检测所有mRNA的表达量的差异；
- 检测RNA结构差异：可变剪接、融合基因、基因但点突变导致的SNP
第一部分：RNA-seq测序方法
1. 去除核糖体RNA（由于rRNA非常保守，极度稳定，提供不了有用的信息）
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illumia公司的Truseq RNA建库方法
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Ploy A尾mRNA和PolyT探针结合，回收磁珠，将mRNA从磁珠洗脱后用镁离子溶液打断；被打断的片段用随机引物进行逆转录成cDNA，再合称为双链cDNA，在双链cDNA两端接上Y型接头
2. 对mRNA的完整度要求较高
由于PolyT探针只能结合PolyA尾，如果mRNA发生断裂（不完整），那么PolyT脱下来的PloyA mRNA则不完整，造成测序数据的偏差。
因此在测序前需要对总RNA的质量进行质检
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28S，18S峰越高越尖越好
RIN：RNA integrity number，0-10分，RIN在8.0以上是illumia公司推荐的标准。
第二部分：RNA-seq测序数据分析
- RNA mapping到基因组上
- RNA完整度
下图显示mRNA的完整度
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RNA表达量分析：RPKM等等
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某基因被测到的read数除以全部可比对到基因组上的read数 （容易理解）
为什么还要除以外显子长度？
因为外显子越长，被镁离子打断出来的片段就越多，因此需要修正mRNA长度引起的read的偏差。 -
火山图等整体差异分析结果
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聚类分析
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GO分析
Gene Ontology：基因功能分类体系
GO：参与的生物学过程；基因产物的功能；基因产物在细胞中的空间定位。
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KEGG京东基因和基因组百科全书
不详细介绍图怎么看。
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RNA结构变异
（1）可变剪接：建议测序深度较深，10G以上（二代测序测长不够长，是零碎状态）
（2）融合基因
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（3）点突变造成的SNP
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