2022年2月山东大学齐鲁医学院研究团队在Cell Mol Gastroenterol Hepatol （IF=9.225）发表文章，利用单细胞转录组测序剖析了人类远端胆管癌（dCCA）的异质性景观和肿瘤微环境（TME）组成。该研究旨在揭示远端胆管癌肿瘤异质性的复杂性。该研究中的单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】Cell Mol Gastroenterol Hepatol
【发布时间】2022年2月
【影响因子】9.225
【关键词】单细胞转录组，远端胆管癌
研究背景
远端胆管癌（dCCA）是一种发生在远端胆总管的上皮细胞恶性肿瘤，约占所有胆管癌病例的40%。dCCA 是一种高度致命的疾病，通常具有显著的细胞异质性。全面探索细胞多样性和肿瘤微环境（TME）对于描述驱动 dCCA 进展的机制至关重要。
研究思路
研究思路图
研究结果
1、单细胞转录组分析揭示人类 dCCA 细胞图谱
构建了 4 名 dCCA 患者的 4 份 dCCA 样本和 3 份匹配的相邻正常胆管组织的单细胞转录组图谱（图 1，A）。共 30,860 个细胞进一步注释为 11 种不同细胞类型，包括 T 细胞、上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、成纤维细胞、B 细胞、神经细胞、肥大细胞和组织干细胞（图 1，B 和 C）。热图展示了每种细胞类型的 top 3 的差异基因（DEG）（图 1，D）。条形图显示了每个样本中细胞类型的比例以及每种细胞类型中每个样本的比例（图 1，E 和 F）。
图1 scRNA-seq 研究人类 dCCA 的单细胞图谱
进一步量化响应 dCCA 恶性肿瘤的细胞类型丰度的变化，确定了跨越 KNN 图的 2446 个邻接，其中 77 个显示了正常（N）和恶性（M）条件之间丰度差异的证据（图 2，B）。将差异丰度结果与之前确定的所有细胞群进行比较，恢复了除肥大细胞群外的所有细胞群中差异丰度的邻接（图 2，C）。
图2 正常（N）和恶性（M）样本之间的差异丰度
2、恶性细胞亚群在人类 dCCA 中表现出肿瘤间和肿瘤内异质性
所有上皮细胞进一步细分为 6 个主要亚群（图 3，A），包括 1 个正常上皮细胞亚群（N）和 5 个恶性亚群（M1-M5），显示出不同程度的 CNV 评分（图 3，B 和 C）。亚群 M1 是最主要的恶性亚群，而 M5 数量最少（图 3，D）。5 种恶性亚型表现出很大程度的瘤间和瘤内异质性（图 3，A）。每种恶性亚型都显示了特异表达的 DEG（图 3，E 和 F）。恶性组织中有 212 个上调基因，正常组织中有 70 个相对高表达的基因（图 3，G）。KEGG 功能富集分析表明，在恶性肿瘤中高表达的基因主要富集于细胞连接、ErbB 和 Notch 等信号通路（图 3，H）。
图3 人类 dCCA 中恶性成分的全面细胞概述和异质性
通过免疫组织化学（IHC）和 qPCR 方法验证每个亚群的 marker 基因表达，并显示了每个样本的形态学特征（图 4）。结果与单细胞转录组数据一致，尤其是在蛋白质水平上。
图4 Marker 基因的表达验证
接下来，采用 SCENIC 方法分析所有恶性上皮细胞亚群并识别不同信号性质的潜在转录因子（TF）（图 5，A）。发现了所有恶性亚群的共同潜在 TF，例如 STAT3 和 Rel（图 5，B），SMARCC2、EGR1、IKZF1、STAT1 和 POU2F3 分别为 M1 到 M5 中具有代表性的基础 TF（图 5，A 和 B）。所有上皮细胞的伪时间轨迹图显示，正常上皮细胞和每个恶性细胞亚群形成一个连续体，但恶性亚群彼此分离，具有不同的表达特征，证实了人 dCCA 中恶性亚克隆的异质性（图 5，C）。正常的上皮细胞群形成了一个根，有 2 个主要的轨迹分支，将 M1 与 M2、M3 和 M5 分开（图 5，D）。基因集变异分析（GSEA）表明所有 M 子集共享一些共同的激活特征，M1 和 M2 亚组共享最常见的途径（图 5，E）。
图5 人 dCCA 组织中恶性细胞的转录组学异质性
3、恶性细胞表现出与 17 号染色体相反的改变状态
有趣的是，低和高 CNV 的 M 亚组特征分别是 chr17q12 - chr17q21.2 的扩增或缺失（图 3，C）。该区域涉及多个显著的肿瘤相关基因，所有这些基因在 M1 中均高表达，而与 N 组相比，它们在 M2 至 M5 中的表达水平相对较低（图 5，F）。伪时间轨迹表达也显示了这些基因在亚组之间差异的表达分布（图 5，G）。并且与 CCA 患者的患者总生存概率密切相关（图 5，H）。
4、人 dCCA 肿瘤中富含细胞毒性 CD8+ T 细胞和免疫抑制性肿瘤浸润性 Treg
在非癌性胆道组织中，仅检测到 naïve CD4+ 和 naïve CD8+ T 细胞（图 6，A），而在癌组织中，鉴定出 4 个不同的 T 细胞亚群（图 6，B）。Naïve T 细胞在肿瘤和非肿瘤组织中均占主导地位，细胞毒性 CD8+ T 细胞是 dCCA 中的主要效应子（图 6，C 和 D）。接下来，使用 iTALK 研究正常组织或肿瘤组织中 T 细胞和上皮细胞之间的细胞间通讯，ERBB2 受体在肿瘤组织中增强，表明阻断 ERBB2 信号传导可能会影响恶性细胞的增殖作用（图 6，E）。
图6 人类 dCCA 中的浸润免疫细胞亚型景观
5、dCCA 和 iCCA 的单细胞数据比较
与已发表的肝内胆管癌（iCCA）单细胞数据进行整合分析，证实了 iCCA 和 dCCA 之间不同的表达变化情况（图 7，C）。总共检测到 45 个基因在 iCCA 中显著上调，而 17 个基因在 dCCA 中过表达（图 7，D）。GSEA分析表明，二者富集了不同的激活信号通路（图 7，E）。
图7 单细胞数据与批量数据以及 dCCA 和 iCCA 之间的比较
总结
本研究全面绘制了人类 dCCA 的单细胞转录组学景观，揭示了高水平的肿瘤间和肿瘤内异质性以及对 dCCA 具有潜在临床意义的关键生物学特征。
参考文献
Li H, Qu L, Yang Y, Zhang H, Li X, Zhang X. Single-cell transcriptomic architecture unraveling the complexity of tumor heterogeneity in distal cholangiocarcinoma [published online ahead of print, 2022 Feb 24]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2022; S2352-345X（22）00041-8.doi:10.1016/j.jcmgh.2022.02.014
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