今天分享一篇空间转录组的文章，在Nature Plants发表的题为“”A spatial transcriptome map of the developing maize ear“”的论文，该研究构建了首个玉米雌穗空间转录组图谱。

A spatial transcriptome map of the developing maize ear

结果1：利用Stereo-seq对玉米雌穗进行空间转录组测序

这个研究中，作者选取的是早期发育（5-10mm阶段）的玉米的穗作为研究对象。这个阶段的雌蕊，分生组织开始逐渐形成特定的结构（图1a）。作者选取的B73近交系的6mm时期的穗的原基部分，这部分包含所有的分生组织。空间转录组用的是华大的Stereo-seq平台。样品也做了一次单细胞测序。从UMI的空间分布来看，作者获得了高质量的空间转录组图谱，因为UMI没有转录信号扩散（不知道是啥意思）（图1b和附图1）。

Stereo-seq芯片上每个DNB之间的直径为220nm，两个相邻点中心到中心的距离为500nm。这个研究中用的是华大自带的系统，空间聚类可选的参数一般是一个二维的bin窗口，比如bin20（~10μm，20×20 DNB），bin50（~25μm，50×50 DNB）和bin100（~50μm，100×100 DNB）。作者使用的是bin50来代表每个spot，去构建穗的空间转录组图谱。去除低质量的bin（基因数<150），每个切片平均含有8639个bin50和28530个表达的基因。对比4个不同的切片，可以发现在每个bin50中，它们之间的UPI和gene数目是相似的，说明stereo-seq之间的重复性比较好。也就是作者得到一个玉米穗的高质量的空间转录组图谱。

结果2：空间转录组数据聚类以及验证

作者基于切片1和2的数据进行聚类，共获得了12种不同的细胞簇（图1c）。
基于玉米雌穗的解剖学结构，定义了10种细胞类型。并且作者发现基于空间图谱，作者可以发现一些的新的细胞类型，比如：发现了3种不同类型的IM（图1d）。包括：IMT：在IM的顶端；IMP：在IM的周围；IM：在中间区域。

为了验证Stereo-seq数据的可靠性，作者接下来查看了切片3和4的聚类情况。UMAP图显示，它们可以分成11和13个细胞类型。比较4个切片数据，MetaNeighbor分析发现至少10个细胞类型可以在4个切片中均被发现。超过70%的marker基因在至少3个切片中重复出现。为了进一步验证数据的准确性，作者挑选了55个marker基因，包括24个在文献中已经报道的，以及31个随机挑选的进行原位杂交实验。原位杂交验证了74%marker基因的有效性。例如KCS15和ZmZNF30分别在表皮和维管束中特异表达（图1e和2f）。
这些结果都说明Stereo-seq可以准确的鉴定不同类型的物理位置以及相应基因的逼到，而有些细胞类型是很难用单细胞实现的。

图1 附图1 附图4

结果3：通过空间转录组数据鉴定到参与分生组织分化的2个MADS基因

接下来，作者探索是否能通过空间转录组图谱解析分生组织时候如何从从没有开始分化的IM分化成其它结构的。由于这些不同分生组织类型高度相似，传统的scRNA-seq策略无法区分它们的空间位置和表达轮廓。相比之下，通过空转转录组图谱则可以区分不同的分生组织类型以及它们的物理位置。因此，作者根据空间位置提取了来自确定的IM、小穗分生组织、花分生组织。切片1包括1182个bin50（ME＝837，IMT＝345），切片2包括1394个bin50s（ME＝970，IMT=424），切片3包含674个bin50s（ME=589，IMT=85）和切片4包含765个bin50（ME=666，IMT=99），作者重新提取出来并重新聚类。聚类后获得了3个簇（图2a），包括：IMT（不确定的分生组织顶端）、DMP（确定的分生组织边缘）、DMT（确定的分生组织顶端）。这些结果表明重新聚类可以分离出高度相似的分生组织类型，从而可以研究基因表达的变化在分生组织分化过程中的作用。
接下来，作者比较这3个细胞类型，来探索是那些关键基因调控了不同细胞类型之间的分化。使用Seurat FindAllMarkers来鉴定了不同cluster之间的marker基因。其中就包含两个MADS基因：ZmMADS8和其同源基因ZmMADS 14（图2b），在DMT中特异表达（图2c，图2d）。先前的研究表明：ZmMADS8和DROOPINGLEAFS的失活可能导致叶片分支的产生，从而说明它可能改变了分生组织的作用。为了确定这个功能，作者基于CRISPR双敲除了ZmMADS8和ZmMADS14。可以看出，单个突变体能产生正常的小穗和花。但是双突变体中花的分生组织换变成了不确定的分支。这表明ZmMADS8和ZmMADS14是调控不确定的分生组织分化成花分生组织的重要靶标（图2e-2p）。作者的研究结果表明ZmMADS8和ZmMAADS14在分生组织分化过程中起着冗余的作用。

图2

结果4：玉米雌穗有2个明显的分化轨迹

接下来，作者使用Monocle2对所有的细胞类型进行了轨迹分析。结果表明，IMT在轨迹的早期出现，表明IMT细胞的分化程度低于其他细胞类型，因此IMT细胞更有可能是轨迹的起源（图3a，3b）。随后出现的是是ME和MI和分生组织的基部区域。到分化的中后期出现的主要有pitch、皮层和维管束。为了验证这种细胞分化轨迹，作者又进行了RNA速率分析，追踪了两个主要轨迹（图3c）：（1） bin50s正在分化为分生组织基部和脉管系统上部区域的（2）bin50正在向原基分化。这些结果说明花的分生组织是垂直分化的，而维管束分生组织是水平分化的（图3d）。

图3

结果5：通过整合单细胞和空间图谱构建玉米雌穗的空间调控网络

虽然空间聚类结果和轨迹分析结果与预期的基本吻合，但是空间转录组学不是单个cell级别的。为了获得额外的细胞水平的信息，作者也构建了这些样品的单细胞转录组数据。因为单细胞转录组和空间转录组联合分析可以解析不同细胞类型并揭示其不同调控功能。经过质控后，获得了14243个细胞和28627个表达基因。
降维聚类后，获得了13个细胞簇（图4a）。作者使用STRIDE整合了单细胞和空间的信息，并计算了每个bin50中单细胞的比例。结果显示，单细胞数据中cluster 0、3、4主要来自于IM，而cluster 1、11、12主要来自于维管束、内部的分生组织和ME（图4b）。切片3和4可以得到相似的结果。为了进一步验证结果的准确性，利用单细胞数据重新鉴定了2864个细胞特异基因（图4c）。除了cluster 11除外，至少5个基因是和空间数据一样的，从而证明了STRIDE用于整合scRNA-seq和Stereo-seq数据的可靠性。

为了探索玉米雌穗的发育，作者接下来利用WGCNA构建了共表达网络。总共鉴定了12个module，其基因表达模型高度相似。例如module 3中40.2%基因在维管束中特异表达（cluster 1）。module 3中的基因主要参与苯丙烷代谢过程（GO:0009699）和苯丙烷生物合成途径（KEGG:00940），这一些一般作为木质素的初始步骤。module 5 中76.9%的基因在IM细胞中显著富集（cluster 4），GO富集结果表明其中主要参与碳代谢途径，例如有机酸分解代谢过程活性（GO:0016054）。module 7中86.7%的基因在ME细胞中特异表达，这些基因显著富含与脂肪酸代谢相关的过程（GO:0006633）
以及角质和蜡的生物合成（GO:00010025）。这些结果表明，同一模块的基因可能在相同的细胞类型中发挥重要的作用，并与特定的区域相关。

为了探索这些细胞中的关键调控靶标，作者利用cytoscape构建了其共表达网络。通过基因连接度曲鉴定hub gene。例如OCK基因在拟南芥中和角质层的合成相关。在module 7中OCL和多个KCS/GLPSSY基因紧密互作（图4d），这些基因也是已知参与角质合成的基因。此外OCL5在ME中特异表达，与角质层的位置类似（图4g），说明它合成的过程中受OCL、KCS、GLOSSY的调控。

此外，作者在module 3中发现了多个laccase基因（lac7/9/11/14/2）。Lac基因一般与木质素的合成相关，表明他们可能参与了玉米维管束的发育。px5和px19和lac基因紧密相关（图4e），空间图谱中pr19在微观中也特异表达（图4g）。lax酶一般将单糖转移到木质素上，因此推测lax酶和px基因共同调节木质素组成。

作者还发现module 5中与海藻糖合成相关，包括关键基因海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trpp14，Zm00001eb018720）和四个海藻糖-6-磷酸合成酶
基因（trps7，Zm00001eb153280；trps15，Zm000001eb370990；
trps5，Zm00001eb98910；和trps10，Zm00001eb192680）。海藻糖-6-磷酸是植物发育的关键信号，过表达TRPP基因增加了结实率和对干旱的抗性。其中NAC25和这些基因高度相关（图4f）。尽管还没有报道证明NAC25对于玉米穗发育的影响，但是基于这个结果可以推测NAC25可能通过调节多种TRPP和TRPS基因来调控玉米穗的发育。

图4