细胞成软骨诱导分化实验

间充质干细胞成软骨诱导过程中，首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。

实验前期准备

1. 细胞：细胞增殖正常，形态正常，尽量使用低代次的细胞。

2. 试剂：试剂分为预混液和诱导液。4℃冰箱溶解和保存试剂，配制时注意：部分试剂是醇溶，注意开盖时间，避免试剂挥发。使用诱导液时，需现配现用。

成软骨诱导步骤和注意事项

1. 间充质干细胞的准备:

将对数生长期的细胞消化下来计数，取3×10^5个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4min。

使用合适的细胞量，30-40万，不超过100万。

弃上清，加入0.5mL成软骨诱导分化培养基基础液，重悬细胞，150g离心5min。小心弃去上清，加入0.5mL成软骨诱导分化培养基诱导液，重悬细胞，150g离心5min。

此步离心后不需要重悬细胞，等待细胞分泌粘多糖或者胶原等物质。

将15mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37℃，5% CO₂培养环境下培养。

离心管可以稍微旋松，避免培养基变碱，并将离心管竖立放置在培养箱中。另外离心管的选择也会影响软骨球的形态和质量，管壁的光滑程度，以及管底的形状，若管底稍圆润，软骨球也会更圆。

2. 细胞分化诱导:

24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况。

离心管静置于培养箱中至少24h，细胞产生足够多的粘多糖，胶原混合物，足以包裹着细胞沉淀，以形成细胞团。若细胞状态差，产生分泌物的能力较低，可延长时间至48-72小时。 

如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。

a. 弹起或挑起细胞沉淀，注意动作轻柔，可以用手触摸管底，使细胞沉淀弹起来。如果发现72小时后还是弹不起来，可以用10微升的枪头，沿着管壁把细胞沉淀刮下来。

b. 弹的不好，可能会不规则生长。如果不小心弹散了，可以离心挽救，再静置，也就是重复以上操作。

c. 一开始软骨颗粒比较小，后续会长大，待长到一定时候，会变大，但还是不会有一开始细胞沉淀大，因为细胞会变得紧密。

置于37℃，5% CO₂培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

2-3d 更换培养，直至形成1.5-2mm的软骨球。每天去弹1-2次，软骨的形态会更圆，但可能弹的时候，球外面的细胞受冲击脱落，培养基会看着浑浊。

诱导后期分泌胶原和细胞会越来越少，如果21天还没有成球，就没有继续做下去的意义了。

成功诱导的软骨球大小

3. 染色鉴定

a. 软骨球固定：将软骨球从离心管中转移至EP管，并使用1×PBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。

b. 石蜡包埋切片：软骨球经石蜡包埋后切片。

切片厚度3um，太厚看不清结构和染色时间结构。

c. 阿利辛蓝染色：将石蜡切片脱蜡，使用阿利辛蓝染液染色30min，用自来水流水冲洗2min，蒸馏水冲洗1次。

背景一定要洗干净，大量水清洗，留下的就是分化好的成软骨。

d. 诱导评估：显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

常见问题

1. 软骨球中间的空洞是什么？

软骨组织本身有孔洞，或者有诱导过程中细胞部分死亡。

2. 诱导后软骨球形状不好？

诱导过程中，弹的不好，或者次数不够，另外就是离心管的选择，球的形状和离心管底形状和管壁黏附程度有关。

3. 软骨球表面光滑和哪些因素有关？

一个是操作的好，也就是弹的好，另外一个原因就是细胞本身粘多糖，胶原分泌的多，会及时填补细胞脱落的空隙，看起来就比较圆。

4. 染色均匀度，球中间没有染上？

分化不均匀，部分细胞没有成软骨。外围的细胞更早接触诱导液，外围的细胞分化以后，可能分泌的粘多糖把外围糊住后，内部的细胞还没有分化。

5. 染色时发现部分染色深，部分颜色浅？

有一定形状的颗粒点，突起点，这部分颜色深，可能是细胞中的粘多糖或者胶原还没有来得及分泌到胞外，因此染色后局部颜色深。颜色稍浅的蓝色是某些细胞较早就把粘多糖等物质分泌出去了。