将RNA占据位点映射到基因组上的技术——ChIRP-seq

今天看到别人介绍的一篇文章里出现了ChIRP-seq技术，猛一看眼熟，再一看，好吧，不认识，只是跟跟“熟人”长得像而已。那今天就来看下ChIRP-seq技术吧。

什么是CHIRP-Seq？

CHIRP(ChromatinIsolation by RNA Purification)是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白相互作用的方法，可同时分析lncRNA/circRNA 、蛋白及DNA三者互作关系。利用ChIRP-seq技术可用于在全基因范围内定位lncRNA/circRNA的结合位点和可能结合的其他RNA分子,是揭示位于细胞核内lncRNA/circRNA 生物学机制的关键实验手段。该方法是通过设计与目标RNA序列反向互补的生物素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附到链霉亲和素磁珠上，最后通过qRT-PCR或测序来测定目的RNA、DNA序列，亦或是通过Western或质谱分析来测定蛋白。

ChIRP技术优势

1.ChRIP实验可研究细胞体内互作；

2.ChRIP实验既同时可研究RNA、蛋白质和DNA形成的复合体之间的互作；也可研究它们之间的两两互作；

3.利用ChRIP-MS实验寻找与目的lncRNA结合的蛋白，可不受lncRNA长度的限制；

4.利用ChRIP实验可研究circRNA与蛋白质或DNA之间的互作。

技术流程

（1）、ChRIP-RNA：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→RNA回收与纯化→NGS或qRT-PCR检测；

（2）、ChRIP-DNA：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→DNA回收与纯化→NGS或qPCR检测；

（3）、ChRIP-Protein：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→蛋白分离→质谱鉴定。

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ChIRP实验标准实验分组如下：

（1）、IP组：目标lncRNA/circRNA Odd组和Even组（即实验组，用于鉴定lncRNA/circRNA作用基因组位置）

（2）、lacZ组：外参对照组，证明ChIRP探针的特异性；

（3）、Input组：捕获前分离提取的基因组DNA，作为内参对照组，证明探针特异性；

（4）、Positive组：阳性对照组，通过已知验证有效的探针，通过WB检测已知结合蛋白质，证明整个ChIRP实验体系的有效性；

（5）、目标lncRNA/circRNAqPCR：证明ChIRP探针对目标lncRNA的正确结合及有效捕获。

案例分析

案列1：ChRIP-protein研究

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结果解析：图A展示的整个ChIRP-WB或ChIRP-MS实验大致的实验流程；图B阐述的是ChIRP实验中U1探针和U2探针富集到的RNA长度分布，结果显示，input组的RNA大小为150-4000nt不等，而U1探针和U2探针富集的RNA长度为150-200nt，说明U1探针和U2探针能有效地富集样本中的U1和U2；图C是U1、U2、U3的ChIRP-WB实验结果，实验结果证明，U1和U2可与U1A蛋白结合，U3可与FIBRILLARIN蛋白结合。

文献：Systematic discovery of Xist RNAbinding proteins

案列2：ChRIP-DNA研究

结果解析：图A展示的是通过生物信息学分析，预测出lncRNA FOXD2-AS1与TRIB3 Promoter的三个结合位点；图B是lncRNA FOXD2-AS1在UM-UC-3细胞中进行ChIRP-qPCR实验结果；图C是ChIRP实验中lncRNA FOXD2-AS1的奇数探针和偶素探针的富集效率检测结果。综合实验结果表明，lncRNA FOXD2-AS1可与TRIB3 Promoter结合，且结合位点位于预测位点的P3位点。
文献：The long non-codingRNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through apositive feedback loop with Akt and E2F1
案列3：ChRIP-circRNA-protein研究

结果解析：图a展示的是图b、c、d实验的简单实验流程图；图b是利用circRNA探针进行的类似ChIRP实验原理的RNApulldown结果；图c是对图a的circRNA-RNA pulldown产物进行qPCR的实验结果；图d是利用circRNA探针进行ChIRP-qPCR实验结果。综合实验结果表明，circEIF3J和circPAIP2能与RNA聚合酶复合体结合，也能与本身目基因启动子结合从而调控母基因的表达水平。
文献：Exon-intron circular RNAsregulate transcription in the nucleus，figuer5.
案列4：ChRIP-circRNA-miR研究

文献：Identification of senescence-associatedcircular RNAs(SAC-RNAs) reveals senescence suppressor CircPVT1
结果解析：图A展示的是circPVT1与microRNA结合位点的预测结果；图B是类似ChIRP实验原理的circRNApulldown原理图；图C是对circRNA-RNA pulldown产物进行circPVT1的qPCR的实验结果，该结果反映的是circPVT1探针的有效性；图D是circRNA-RNA pulldown产物进行microRNA qPCR检测的实验结果。综合实验结果表明，circPVT1能与has-let-7有效结合，从而达到富集细胞内的游离的has-let-7，进而间接调控has-let-7的下游靶基因。

参考资料：
1.https://mp.weixin.qq.com/ssrc=11&timestamp=1553006880&ver=1494&signature=AWIMyS0Lk7PQQQwmH03Iaar8XdzFaQ8NS3LfXkDzBI4lD3mauaQJWVP33hI4dITWNFDNSoOjMhXYWu3WbXYb5YI5phRf2*Opbqc6ZFATCntQUnsovfKACvIw0se&new=1
2.https://mp.weixin.qq.com/ssrc=11&timestamp=1553006880&ver=1494&signature=gc3BlRst8fqGsKBszKOFlqU7Oo8kPf5xcB4XLGjrl8lIGyXW6O5FzaEkrKo4H9EeYjAEyQPCzItqJpq9PfyHwPMUOPlYybWQ1P0GMbWaNws9pYPxWtY3nntN0&new=1
3.https://mp.weixin.qq.com/ssrc=3&timestamp=1553006880&ver=1&signature=8LqnnZIt8R3uBO48vfzIo7sY7dnz0PAMHZWx6c3lHmzITKSsu1DyNgWs2W8UsywAVsnmgskqTAGRk0N2FyfoWrx9twNZQ8pLc0MJW7uPKgJNPLIGiVCXXhWVGFw8zoqUAZjGWtMhqvKI3P9pdUcg==
4.https://mp.weixin.qq.com/ssrc=11&timestamp=1553006808&ver=1494&signature=eIoZmzVNTOjGWUpOSa0iFKk0cl57iQ4WHIgz9TrOfXIqp56Zx7fRvcW7To9ybPnpdzuqxzbsjKFPfFB0s6Jza9Afg59YuhbrdyJCfUHgejFdW0R3zAUCNrH13B&new=1
5.https://mp.weixin.qq.com/ssrc=11&timestamp=1553003799&ver=1494&signature=t2niTBGNAfGxSsjeQFJ27rbmuRThxSHwfi1ZtNdYpqZYrqhjF3gXX0KR7uUwXJQBeazcVetQS2aX7JveQam4rhcSVSruk2GqBAYKnIPlO6MtlHpC8CFy5whvoyqQ&new=1