学习小组Day7笔记--damon

作者: Damon伍 | 来源:发表于2018-09-16 23:13 被阅读13次

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今天的内容，真的是不求甚解。。以下内容参考至生信星球和刘小泽-测序的世界。https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

区分一二三代测序

一代测序：Sanger法测序

Sanger法

图片引用自刘小泽，测序的世界。https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来，测序分为四个反应容器，每个容器加入四种核糖核苷酸dNTP和某一种双脱氧核糖核苷酸ddNTP，DNA合成的时候就会随机的引入这种双脱氧核糖核苷酸，从而不能继续合成，这样DNA片段就到这个位置终止。通过电泳，就可以将四条泳道的DNA产物按照大小分开，根据模板DNA合成的序列就可以从下向上一次读出，如上图图所示，序列为TACTGACTCG

二代测序

如Illumina，可有4个主要步骤：原理介绍视频：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码：密码：bxsry4

1.Sample preparation
2.Cluster generation
3.Sequencing
4.Data analysis
1.Sample preparation

超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。
作者：刘小泽
链接：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

2.Cluster generation

flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。
桥式PCR： PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍
循环：大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，称为cluster，这是一群完全相同的序列。目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求
作者：刘小泽
链接：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

图片引用自生信星球

3.Sequencing
分三步：DNA聚合酶聚合带荧光且具有保护基团的NTP（可终止反应），荧光标记簇成像，保护基团被切除进行下一个循环

illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效”的办法。illumina的测序就是在Sanger基础上加上了桥式PCR，能克服Sange低通量的缺点

sequencing

三代测序

又被为"Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing"（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列，解决了初始模板DNA扩增的偏好性问题。它也采用边合成边测序方法，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
有人说三代准确率低，又有人说非常高？
目前的几种技术：