RNA-seq

可以帮助我们了解，各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。
应用：正常组织/肿瘤组织；治疗前/治疗后；不同发育阶段；不同组织之间等。
检测范围：mRNA表达量；mRNA的可变剪接；融合基因；SNP

测序方法

建库（illumina公司的Truseq RNA建库）
正常抽提到的总RNA有95%是rRNA，只有2-3%是mRNA。
文库质量要求：mRNA要完整。建议先对总RNA进行一次电泳质检，并进行打分。
RIN值（RNA Integrity Number）范围为0-10分，建议使用8.0以上的样本进行检测。

RNA质检
建库流程
建库流程

1. 带Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，吸附其中的带Poly(A)尾巴的mRNA，回收磁珠，把带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来
2. 把洗脱下来的mRNA用Mg2+溶液进行处理，把mRNA打断
3. 被打断的mRNA片段用随机引物进行逆转录，形成第一链cDNA
4. 合成第二链，形成双链cDNA
5. 在cDNA的3'端加上A碱基
6. 在双链cDNA的两端接上Y形接头
7. 经过PCR扩增，成为可以上机的文库

生信分析

判断标本质量

先把测到的RNA片段mapping到基因组上，检查一下多少片段在3'端位置，多少在5'端位置，来判断mRNA是否完整。

mRNA完整时，图形趋于饱满
mRNA有一定程度降解，5'端比3'端低

mRNA表达量差异分析

RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）

RPKM公式
1. 火山图
火山图——两个样本的RNA表达量的对比
横轴：某个基因的表达量是上升（→）还是下降（←）。
纵轴：差异的置信程度。红：置信程度较高；蓝：置信程度较低。
每个点：两个样本当中同一个基因的mRNA表达量的变化
左图差异大于右图

2. 聚类分析
通过多个样本的全基因表达谱对比，来找到他们之间的相似性和相近关系。

横轴样本，纵轴基因
应用：分析疾病亚型；探索新的Biomarker。

3. GO分析（Gene Ontology）
Gene Ontology：国际化的基因功能分类体系。主要描述三个属性：参与的生物过程；基因产物的功能；基因产物在细胞器内的空间定位。

差异基因GO富集柱状图
显示在生物过程、细胞组分、分子功能富集的差异基因的个数分布情况。
有向无环图
从上到下，它所定义的功能范围越来越小，越来越精准。分支表示包含关系，颜色越深表示富集关系程度越高。

4. 通路分析
通路（Pathway）是指在系统水平上完成生物的某一功能的基本单元或者局部子网络。
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）（基因功能数据库）

散点图
衡量指标：Rich factor、Q value、富集到此通路上的基因个数。点的面积越大，富集的基因数越多；富集因子越大，富集程度越大；Qvalue越接近0，富集程度越显著。

RNA的结构变异分析

需要测序深度较深，建议10G以上数据量。

1. 可变剪接

2. 融合基因

   
   一个癌细胞中的融合基因示意图
   融合基因交接点
3. 点突变
   表示点突变的泡泡图
   Frequency越高，泡泡越大，逆时针排列。

以上内容均源于网络视频《陈巍学基因——视频7：RNA-seq》。