0.前期准备
先在工作目录下创建以下几个目录：
01.raw_data #用于存放原始数据
02.fastq #用于存放fastq格式数据
03.fastqc #用于存放QC结果
04.trinity_result #用于存放trinity结果
数据处理的顺序：01.raw_data > 02.fastq > 03.fastqc > 04.trinity_result
1.下载SRA
先cd到01.raw_data目录下，执行以下命令（二选一）：
nohup axel -q ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR130/SRR1300434/SRR1300434.sra &
axel是一种多线程下载工具，比wget快；-q参数能让axel进入静默模式（选用）。
nohup wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR130/SRR1300434/SRR1300434.sra &
用wget的时候记得加-c参数，支持断点续传，就会方便很多。
用脚本批量下载数据的代码参考附录里的内容。
2.fastq-dump
fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files file.sra --split-3 -O|--outdir
这个是trinity给的命令，如果后面要用trinity进行无参组装的就需要加上--defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri'这串看不懂的“乱码”，就要用这个命令，否则trinity会报错说无法识别这个格式。
经过改良后的命令：
nohup fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-3 file.sra -o ../02.fastq &
默认输出在上一层目录的02.fastq这个文件夹里。
-o：重定向输出结果的位置。将结果输出到上一级目录下的02.fastq文件夹内。
可选用的参数：
--gzip, --bzip2: 以压缩文件的方式输出结果。有利于减少文件的占用空间。
3.质控
不管什么数据，质控一下还是很有必要的，多看fastqc结果，即是积累经验，也是及时发现数据可能出现的问题。首先cd到../02.fastq，之后执行：
fastqc -t 8 *.fq -o ../03.fastqc
-t: 使用的线程数。现在用的服务器是20 CPU 40线程，以后这个值可以改大一点(range from 1~40，但是一般取10，如果文件比较多可以取20。)
-o: 重定向输出结果的位置。放在03.fastqc里面。
用filezilla登陆服务器找到对应文件夹将生成的html文件下载到本地进行查看。如无问题则可进行下一步Trinity的操作，如有问题则进行质控部分余下的操作。
因为篇幅原因，将单独写一个关于如何查看fastqc结果的教程。敬请期待
需要去除接头的情况：
- cutadapt
- trimmomatic
需要对双端测序数据进行过滤低质量reads操作的情况：
- sickle
当你想改善你的数据的问题但是你又新入门啥软件都不会的时候（推荐使用）：
- fastp
fastp -i name.fastq -o name.fastp.fastq #单端
fastp -i name_1.fastq -o name_1.fastp.fastq -I name_2.fastq -O name_2.fastp.fastq #双端
4.Trinity
cd到../fastq文件夹后，执行以下命令：
双端测序命令：
nohup Trinity --seqType fq\fa --left ? --right ? --CPU 20 --max_memory 50G -output ../trinity_result/?.trinity &
-
left和right不能随意设置，left必须是_1，right必须是 _2.
-
一般type是fq
-
将
?的位置用具体需要操作的文件名代入即可。
单端测序命令：
nohup Trinity --seqType fq\fa --single ? --CPU 20 --max_memory 50G -output ../trinity_result/?.trinity &
ps：输出结果的名字里必须含有trinity这个关键词，否则无法正常运行。
5.TransDecoder
cd到../trinity_result/filename.trinity文件夹下后，找到一个叫做Trinity.fasta的文件，执行：
#step 1: 提取最长的开放阅读框
TransDecoder.LongOrfs -t ./Trinity.fasta
#step 2: (可选),BlastP搜索和Pfam搜索
#BlastP搜索：蛋白库搜索， Swissprot (快) or Uniref90 (慢 but more comprehensive)
blastp -query transdecoder_dir/longest_orfs.pep -db uniprot_sprot.fasta -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 10 > blastp.outfmt6
#Pfam搜索：肽或蛋白域预测，需要安装hmmer3和Pfam数据库
hmmscan --cpu 8 --domtblout pfam.domtblout /path/to/Pfam-A.hmm transdecoder_dir/longest_orfs.pep
#step 3: 将Blast和Pfam搜索结果整合到编码区域选择这个步骤在尝试中发现比较费时间，建议用nohup命令进行操作。
nohup TransDecoder.Predict -t target_transcripts.fasta --retain_pfam_hits pfam.domtblout --retain_blastp_hits blastp.outfmt6 &
nohup TransDecoder.Predict -t trinity.fasta & #简化版
通过TransDecoder这一步将能获得cds、pep、gff3、bed文件。用filezilla将以下五个文件拿到本地：
-
Trinity.fasta、 -
Trinity.fasta.transdecoder.cds、 -
Trinity.fasta.transdecoder.pep、 -
Trinity.fasta.transdecoder.gff、 -
Trinity.fasta.transdecoder.bed将这几个文件以可分辨的名字进行命名（如改成SRR1300215.fasta等）。
6.出个统计报告
还是在本目录下，对Trnity.fasta文件进行操作：
TrinityStats.pl trinity_out_dir/Trinity.fasta >> stat.txt
会生成一个统计报告，并将内容重定向到stat.txt这个文件中。这个文件也记得保存下来。
结果展示。
以SRR1300215为例：
################################
## Counts of transcripts, etc.
################################
Total trinity 'genes': 1524
Total trinity transcripts: 1793
Percent GC: 54.43
########################################
Stats based on ALL transcript contigs:
########################################
Contig N10: 1008
Contig N20: 757
Contig N30: 597
Contig N40: 487
Contig N50: 397
Median contig length: 291
Average contig: 379.04
Total assembled bases: 679625
#####################################################
## Stats based on ONLY LONGEST ISOFORM per 'GENE':
#####################################################
Contig N10: 965
Contig N20: 715
Contig N30: 559
Contig N40: 461
Contig N50: 382
Median contig length: 287
Average contig: 369.46
Total assembled bases: 563055</pre>
7.附录
批量下载sra文件的脚本模板(mac版本，仅供参考)
# 在终端运行
#用axel下载会快一些
brew install axel
for i in {56..62}
do
# 也可以用wget 下载
axel ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747/SRR35899$i/SRR35899$i.sra
done
批量处理fastq-dump的脚本模板：(从人家的教程里摘下来的，仅供参考)
#!/usr/bin/env bash
for i in {56..62}
do
fastq-dump --gzip --split-3 -O /Users/chengkai/Desktop/zhuanlu_files -A SRR35899${i}.sra
done
8.参考来源
文章：
-
转录组入门二（mac版）：读文献下数据
Author：thinkando
-
Fastq-dump: 一个神奇的软件
Author：hoptop
-
转录组入门三（mac 版）：了解fastqc测序数据
Author：thinkando
-
使用Trimmomatic过滤低质量序列
Author：To_2019_1_4
-
TRANSDECODER寻找和预测ORF
Author：冰冻三丈
微信公众号：
-
生信菜鸟团
-
生信者言
9.版权信息
Author：陈俊浩 Hanschen
QQ：1020607557
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