写在前面
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之前介绍过使用
EggNOG-mapper对非模式物种快速完成KEGG注释的推文https://mp.weixin.qq.com/s/kIf6C2u3FID3ZeLtsB4eZQ，不过毕竟EggNOG-mapper是第三方软件，而且注释结果仍然存在一个Gene ID对应多个KO Number的情况，虽然对富集结果影响似乎不会太大，但是影响多少肯定是会有。 -
这里介绍KEGG官方提供的注释工具KofamKOALA，同样能够对任意物种进行KEGG注释，注释结果中Gene ID对应唯一一个KO Number，避免了大多数第三方注释工具一个ID对应多个KO Number的情况，使富集结果更加可靠！
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KofamKOALA官网
https://www.genome.jp/tools/kofamkoala/
一、网页版KofamKOALA
点击提交任务之后需要在邮件中二次确认，提交任务
注释完成之后，点击邮件中的链接
- 在结果页面中，可以直接下载注释结果，然后接着用TBtools进行富集分析
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同时也提供了许多对注释结果的探索功能，比如查看注释上的KO Number详细信息，比对情况等。
二、本地化KofamKOALA
- 如果需要注释的序列太多，文件太大，使用网页版工具确实可能会太慢。这个时候当然是选择将其本地化！在本地根据服务器情况提高线程加速注释。
下载 KOfam 和 KofamScan
下载并解压KOfam
wget https://www.genome.jp/ftp/db/kofam/ko_list.gz
wget https://www.genome.jp/ftp/db/kofam/profiles.tar.gz
#下载完成之后解压
gunzip ko_list.gz
tar -xzvf profiles.tar.gz
下载并解压kofam_scan
wget https://www.genome.jp/ftp/tools/kofam_scan/kofam_scan-1.3.0.tar.gz
tar -xzvf kofam_scan-1.3.0.tar.gz
将kofam_scan加入环境变量
echo export PATH=/home/jiawei_li/tools/kofamscan/kofam_scan-1.3.0:\$PATH >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
安装依赖，KofamScan需要Ruby，HMMER和GNU Parallel
#版本需求
- Ruby >= 2.4
- HMMER >= 3.1
- GNU Parallel
conda安装Ruby，自己编译也行 但是我比较懒折腾。。。
conda install -c conda-forge ruby
- 如果喜欢手动装Ruby，也可以试试，但也许会报错，需要进行一系列操作去安装
wget https://cache.ruby-lang.org/pub/ruby/3.1/ruby-3.1.0.tar.gz
tar -xzvf ruby-3.1.0.tar.gz
cd cd ruby-3.1.0
./configure
make
make install
- 安装hmmer
conda install -c bioconda hmmer
- 安装GNU Parallel
conda install -c conda-forge parallel
修改配置文件，指定依赖软件以及KOfam的路径
首先获取相关软件的路径（注意：配置文件中不需要指定Ruby的路径，但是需要确保Ruby加入了环境变量，能够直接调用）
which parallel hmmscan
#/tools/parallel
#~/miniconda3/bin/hmmscan
使用官方模板，修改配置文件
cd kofam_scan-1.3.0
cp config-template.yml config.yml
- 注意，由于hmmscan和parallel都已经加入环境变量，可以直接调用，因此在配置文件中无需配置这两个软件的路径
# Path to your KO-HMM database
# A database can be a .hmm file, a .hal file or a directory in which
# .hmm files are. Omit the extension if it is .hal or .hmm file
profile: /home/jiawei_li/tools/kofamscan/profiles
# Path to the KO list file
ko_list: /home/jiawei_li/tools/kofamscan/ko_list
# Path to an executable file of hmmsearch
# You do not have to set this if it is in your $PATH
#hmmsearch: /home/jiawei_li/miniconda3/bin/hmmscan
# Path to an executable file of GNU parallel
# You do not have to set this if it is in your $PATH
#parallel: /tools/parallel
# Number of hmmsearch processes to be run parallelly
cpu: 8
对蛋白序列进行注释（注意：注释序列必须为蛋白序列）
exec_annotation -o test.querry2KO --cpu 8 --format mapper -E 1e-5 test.pep.fa
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注意：
--format参数在help中给出了四种，但主要有两种格式。
#help文档中的解释
-f, --format <format> Format of the output [detail]
detail: Detail for each hits (including hits below threshold)
detail-tsv: Tab separeted values for detail format
mapper: KEGG Mapper compatible format
mapper-one-line: Similar to mapper, but all hit KOs are listed in one line
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--format mapper对每一个Gene ID只保留最佳的KO Number，结果文件只含有Gene ID和KO Number的映射信息。
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--format detail保留所有信息，包括Gene ID对应上的每一个KO Number，比对分数，E-value以及KO Number的详细信息等。
最后，拿到query2KO文件之后，就可以用其当背景文件，使用TBtools对基因集做富集分析啦
写在后面
学期末了，祝各位老铁这学期的奋斗都有所收获！
大家都能回家安心过个好年，见见许久未见的老友哈哈
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