文章发表于nature review genetics：Integrative single- cell analysis，作者是Tim Stuart与Rahul Satija。做过单细胞分析的对他们应该不陌生。

摘要

scRNA-seq技术的发展契合了研究个体细胞表观遗传、空间研究、蛋白质组与谱系信息的方法需要，这为研究多类型数据的综合方法提出了独特的机遇与挑战。综合分析可以发现细胞之间的模式关系，获取细胞的整体状态信息，产生涵盖不同样本与不同研究手段的数据集。该文重点讨论了单细胞基因表达数据与其他类型的单细胞分析方法的整合。

一些概念

多模态（Multimodal）数据：多种类型数据的组合，如RNA与蛋白质数据组合，是一种多维度数据，类似多组学。
单模态：单个类型数据
Pseudotime：拟时分析
联合聚类（Joint-clustering）：通过联合不同类型数据对细胞进行分组。
典型相关分析（CCA）： 利用综合变量对之间的相关关系来反映两组指标之间的整体相关性的多元统计分析方法。
动态时间规整（Dynamic time warping）：一种局部拉伸或压缩两个一维矢量以校正一个矢量相对于另一个矢量的滞后的方法。
MNNs：标准化基因表达空间中最临近的细胞。聚类用校正批次效应。
梯度推进（Gradient boosting）：一种预测模型算法。

概述

随着分子生物学、微流控与纳米技术的发展，催生了许多类型的单细胞测序技术。过去的方法集中在单模态测量上，如DNA序列、RNA表达量和染色质可及性上。虽然这些技术促进了我们对细胞多样性与发育景观的理解，但是它们并不能很好地解析单细胞内分子间互作关系。而这些互作关系是深入探索细胞状态的关键。此外，随着可用数据集规模的快速增长，迫切需要用于标准化与联合分析且考量到批次效应与个体差异的计算方法。
scRNA-seq是应用最为广泛的单细胞测序技术之一。而后出现了一系列互补技术如单细胞基因组、表观基因组和蛋白质组分析技术，涵盖了单细胞基因组测序（Vitak, S. A. et al., 2017; Navin, N. et al., 2011）、染色质可及性（Pott, S., 2017; Corces, M. R. et al., 2016; Buenrostro, J. D. et al., 2015; Cusanovich, D. A. et al., 2015; Lake, B. B. et al., 2018）、DNA甲基化（Luo, C. et al., 2017; Smallwood, S. A. et al., 2014; Guo, H. et al., 2013; Mulqueen, R. M. et al., 2018）、膜蛋白（Stoeckius, M. et al., 2017; Peterson, V. M. et al., 2017）、小RNA（Faridani, O. R. et al., 2016）、组蛋白修饰（Gomez, D. te al., 2013; Rotem, A. et al., 2015）和染色体构象（Ramani, V. et al., 2017; Nagano, T. et al., 2013）等技术。目前已开发出研究单细胞空间结构和谱系信息的方法（Frieda, K. L. et al., 2017; Shah, S. et al., 2016）。

单细胞多模态综合分析方法示意

Multimodal and integrative methods for single- cell analyses
目前已有多种方法测定单细胞各个时期不同参数，这些方法可以大致分为细胞状态分析、细胞谱系分析、拟时分析三大类，图中适用于不同类型的分析方法均已标注

单模态与多模态分析方法汇总

Unimodal
Multimodal

CEL-seq：线性扩增测序法
CITE- seq：膜蛋白丰度与基因表达水平测定
G＆T-seq：基因组转录组测序
LINNAEUS：谱系追踪
MARS-seq：大规模平行单细胞RNA测序
MEMOIR：谱系与空间结构测定
MERFISH：主要是细胞间结构测定
osmFISH：环状单分子荧光原位杂交，空间结构测定
REAP- seq：膜蛋白丰度与基因表达水平测定
scATAC-seq：单细胞空间结构测定
scBS-seq：单细胞甲基化测序
scChIP-seq：单细胞ChIP-seq
scGESTALT：结合CRISPR-cas9的谱系追踪弄方法
scHi-C-seq：测定染色体组装
sciATAC-seq：结合index转座酶的scATAC-seq
sci-CAR：利用index联合分析mRNA和染色质可及性谱
sci-MET：利用index分析单细胞甲基化水平
sci-RNA-seq：结合index的scRNA-seq
SCI-seq：单细胞组合标记测序，检测CNV
scM＆T-seq：单细胞甲基化组和转录组测序，可研究未知的DNA甲基化与基因表达之间的关系
scNOMe- seq：核小体占位与甲基化组测序
scRRBS：单细胞限制性代表区域甲基化测序
scTHS- seq：单细胞转座体超敏性位点测序
seqFISH：内含子序贯荧光原位杂交，扩展观测到基因数量
snmC-seq：单核甲基胞嘧啶测序
SNS：单核测序
SPLiT-seq：丐版scRNA-seq
STARmap：原位单细胞测序

理想的实验流程应当全面洞悉细胞的所有方面，包括分子状态、空间构象、胞外环境互作的全部过程。尽管当下技术手段无法做到，但多模态技术与综合计算方法可以是我们离该目标越来越近。文章希望提出整合单细胞转录组学、基因组学、表观组学与蛋白组学的数据统一分析方法，重点在结合其他数据类型分析scRNA-seq数据，尤其是整合来自于同一细胞的不同类型数据。

文章分为四大块，首先探讨了多模态单细胞分析方法，其次研究了不同实验不同数据整合分析，然后讨论了单细胞空间测序数据整合分析方法，最后给出了整合分析方法的前景与必要性。

1.单细胞多模态测序方法

最初的单细胞分析方法主要关注细胞某状态下的某类分子水平。而现在更引人瞩目的是同时分析单细胞内多种分子以建立更全面的单细胞分子视图。通常这些方法是将scRNA-seq数据与其它分析手段的结合，目前主要有四种策略从单细胞中得到多模态数据：

Performing single- cell multimodal measurements

1.1FACS结合scRNA-seq

严格来说这种方法算单模态。
一些scRNA-seq workflow采用流式分选细胞，随后进行scRNA-seq（MARS-seq/Smart-seq/2），这样可以同时获得单细胞与对应的荧光信号，将荧光所表示的蛋白质水平与转录组在同一细胞中关联（Ramsköld, D. et al., 2012; Jaitin, D. A. et al., 2014; Picelli, S. et al., 2013 ）。早期研究（Hayashi, T. et al., 2010）利用FACS结合半定量RT-PCR（作者称之为FBSC‐PCR），结合scRNA-seq，明确了细胞表面marker可以区分细胞类型与状态(Wilson, N. K. et al., 2015;该文结合了Smart-seq2)，(Paul, F. et al., 2015;该文结合了MARS-seq)和鉴定稀有细胞的思路。Paul, F. et al., 2015与Nestorowa, S. et al., 2016利用该workflow研究发现了小鼠造血祖细胞由转录组定义不同细胞簇的免疫表型，Wilson, N. K. et al., 2015则分离了小鼠HSCs，鉴定细胞维持干性相关的表面marker。但是囿于荧光光谱的重叠现象，利用该法测到的每个细胞的参数范围有限。

FACS & scRNA-seq

1.2细胞内组分分离分析

针对荧光无法分选的部分，FACS显然是不合适的，尤其是需要同时测得单细胞基因组与胞内蛋白的scRNA-seq实验。此时需要物理分离或通过不同tag筛选出不同组分。

separation & tag

G&T-seq通过加入oligo(dT)特异性分离mRNA同时保留基因组DNA从而实现了基因组转录组平行测序（Macaulay, I. C. et al., 2015）DR-seq通过则通过加入barcode特异扩增cDNA序列实现基因组转录组平行测序（Dey, S. S. et al., 2015）。这使得单细胞基因表达水平与其对应基因型联系起来，深度揭示单细胞间DNA拷贝数变异与染色体重排对下游mRNA丰度的具体关联。这些方法适用于研究体细胞基因高度变异的肿瘤组织。

G&T-seq
DR-seq

DNA甲基化与转录组水平结合研究是基于Macaulay, I. C. et al., 2015的G&T-seq和 Smallwood, S. A. et al., 2014的scBS- seq技术发展的，同普通BSP一样，用亚硫酸氢钠处理DNA片段随后进行扩增，结合G&T-seq，可以分析同一细胞内的DNA甲基化模式和基因表达数据（Angermueller, C. et al., 2016）。由于DNA甲基化存在不稳定性和异质性，因此若要研究DNA甲基化与基因表达间的关系，则必须将表观基因组变异与细胞间的异质性区别开来。
通过DNA甲基化与转录组关联分析，为启动子甲基化与基因表达间的负相关性提供深层次的证据。此外，利用barcode系统选择性标记基因组DNA与cDNA，结合index系统，可以对数千个单细胞进行染色质可及性与基因表达水平间的关联分析，同时鉴定出影响基因表达的顺式调控元件（Cao, J. et al., 2018）。

关于胞内蛋白与mRNA关联研究，有两种思路可供借鉴。其一（Darmanis, S. et al., 2016）是将FACS sort到的细胞裂解后分离裂解液，分别进行蛋白质与RNA定量。作者采用PEA (邻近探针延伸分析) 检测蛋白并用RT-qPCR定量，采用qRT-PCR定量mRNA。该法可以同时检测82个mRNA/75个蛋白；其二（Genshaft, A. S. et al.）是将FACS sort到的细胞在微流控芯片中同时进行逆转录和PEA而不分离裂解液。该法可以同时检测96个mRNA/38个蛋白。这两种方法检测的蛋白与mRNA数量与质量均有限。

分离裂解液分别检测 不分离裂解液同时检测

1.3泛化测序数据统一

1.3
此处泛化统一是指将多种数据类型（蛋白数据/谱系数据/基因表达数据）整合为一个通用型数据类型。
CITE-seq与REAP-seq可以同时将细胞表面膜蛋白信息与mRNA转为cDNA信息，通过测序可以同时检测到二者实际水平。具体是利用带有polyA的不同barcode的抗体结合细胞表面蛋白，barcode可以与mRNA一起检测。与FACS-scRNAseq相比，针对不同表位的不同抗体barcode都是特异的，可以从根本上消除荧光信号重叠对检测数量的限制，这使得区分不同免疫细胞的细微差别成为可能。但是该法对于胞内蛋白与mRNA共检测是行不通的。作者认为可以与PEA结合来解决这一问题，或是采用SPLiT-seq、sci-RNA-seq的研究思路来解决。

这些技术的出现表明若将可以细胞信息转化为有序的barcode，我们就可以在分析单细胞转录组时将这些信息同时获取。这种策略不仅适用于分析细胞的自然状态，也适用于大规模基因扰动研究。目前有Perturb-Seq（Dixit, A. et al., 2016）和CRISPR-Seq（Adamson, B. et al., 2016; Datlinger, P. et al., 2017; Jaitin, D. A. et al., 2016），他们将scRNA-seq与CRISPR-cas9结合进行遗传筛选，使得研究正向遗传学的大规模基因扰动试验成为可能。具体原理是给单个基因扰动和受到影响的细胞添加barcode，通过scRNA-seq能够鉴定出这两者，从而推断CRISPR靶向基因和由此产生的单个细胞的转录谱间的关系。目前应用在基因调控网络（Dixit, A. et al., 2016）、未折叠蛋白反应（Adamson, B. et al., 2016）、免疫细胞分化发育（Datlinger, P. et al., 2017）和T细胞受体激活（Jaitin, D. A. et al., 2016），非编码区调控元件（Klann, T. S. et al., 2017）。此外，还可以结合CRISPR-dcas9系统，扩展到转录调控、表观遗传调控领域中（Thakore, P. I. et al., 2016; Liu, X. S. et al., 2016; Hilton, I. B. et al., 2015; Konermann, S. et al., 2015; Gilbert, L. A. et al., 2017）,18年发展了同时靶向和敲除基因的技术（Boettcher, M. et al., 2018）。

另一个应用是结合CRISPR-cas9的谱系追踪技术。单细胞谱系追踪是去年的大热方向之一，此处提到三种mRNA+lineage方法：scGESTALT、ScarTrace、LINNAEUS。这三种方法各有不同，但大体是利用CRISPR-cas9连续切割结合到基因组上的barcode，细胞会用NHEJ来应对这种损伤。但NHEJ容易出错，从而在DNA序列中产生随机突变，这些突变通过细胞分裂进行遗传，结合scRNAseq利用这些突变作为复合barcode来构建组织或器官发育谱系。

scGESTALT原理

另一种略有不同的方法是MEMOIR，它结合smFISH与CRISPR-cas9系统，可以同时检测细胞谱系与空间位置。

1.3 scRNA-seq数据挖掘

普通的scRNA-seq流程除了可以做转录本丰度外，还可以进行诸如体细胞突变、遗传变异、RNA isoform等分析。

image.png

关于体细胞突变目前已有研究（Lodato, M. A. et al., 2015）,该文通过对人大脑的少量单细胞全基因组测序，分析了发生的细胞突变，构建了人大脑神经细胞谱系。作者发现突变大多发生在高转录活性相关位置，这表明可能可以通过scRNA-seq数据来分析神经细胞突变情况，根据转录状态重构神经细胞谱系。此外，分析scRNA-seq数据中的拷贝数变异，可以研究癌症非整倍体与异质性等情况（Tirosh, I. et al., 2016; Fan, J. et al., 2018）。
单细胞分析也为理解DNA自然变异如何影响基因表达与细胞状态提供了新思路。有研究结合GWAS+scRNAseq，鉴定出了不同个体之间的eQTL（Kang, H. M. et al., 2018）。

1.4 多模态数据分析

多模态测序策略正在催生与之相匹配的数据分析方法。多模数据集可以检测到细胞间的细微差异，而单模数据很可能无法做到这一点。由于scRNAseq数据存在dropout，故而它更容易忽略细胞间的细微差别；但与来自同一细胞的其他数据互补分析可以改善这一问题。例如，很难通过scRNA-seq数据区分不同的T细胞亚群，但联合膜蛋白分析则可以显著提高亚群分辨率（Stoeckius, M. et al., 2017），同样，RNA+chromatin、RNA+methylation联合可能揭示单个细胞间的调控异质性，不再赘述。

多模数据联合聚类分辨率更高

单细胞多模态分析思路很可能受到bulk-seq多组学联合分析的启发（Meng, C. et al., 2016），Argelaguet开发了一种名为MOFA( multi- omics factor analysis)的方法，该方法在多组学bulk-seq数据中效果良好，同时测试了单细胞DNA甲基化数据与RNA数据联合处理情况，效果也可以。这暗示适用于bulk-seq的多组学数据处理方式可能也适用于单细胞多模态数据。鉴于单细胞数据规模远超bulk-seq，多视图机器学习不失为一种重要的补充手段（Colomé- Tatché, M. & Theis, F. J., 2018）。
单细胞多模态研究策略为解析细胞内不同组分间的关系提供了新方法。如CITE-seq和REAP-seq可以轻易鉴别出相关度较低的RNA-protein模块，表明此处存在活跃的转录后调节。还有一个很有意思的是通过测量剪接过的成熟RNA与未剪接RNA的相对丰度，可以建立RNA与蛋白的关联动态模型（La Manno, G. et al., 2018）。
此外，还可以在不同类型数据间建立统计模型。前面提到的sci-CAR文章建立了染色质可及性与基因表达水平间的统计模型，通过染色质可及性数据估计细胞内基因表达水平（Cao, J. et al., 2018），另一组研究人员建立了gRNA与基因表达水平间的线性回归模型，用以识别细胞应答的前后关系，重构转录网络（Perturb-Seq（Dixit, A. et al., 2016））。通过这种手段可以研究目标物种复杂的调控网络。

不同数据类型间的线性模型

2. 不同来源测序数据整合

前面主要讲了在同一测序实验同一批细胞进行的多模态数据整合，而不同测序实验数据整合分析才是亟需解决的关键问题。同bulk seq 数据一样，处理批次效应是综合分析不同实验室、不同workflow产出数据的首要问题（SVA包（Leek, J. T. 2014））。然而目前bulk seq水平的处理方法无法处理单细胞数据（（Haghverdi, L, et al., 2018，作者用MNN处理数据，该法在mnnpy中得到改进）; Butler, A, et al,. 2018）。目前最新方法利用CCA/MNN可以识别出两个数据集间共有的部分，判定细胞间共有的生物学状态,然后以这些相同状态的细胞为基准消除批次效应。

不同来源数据整合方法，CCA/MNN

2.1 常规scRNA-seq数据整合分析

此处作者介绍了他自己在Seurat V2中开发的方法（Satija, R, et al., 2015;），该法用CCA鉴别出不同数据集间相同的细胞类型且可以避免出现由批次效应或常规PCA造成的假阳性细胞类型；接下来采用动态时间规整算法校正数据集间细胞密度差异。这两步骤可以将细胞投影到一个低维空间，具有相同生物学状态的细胞相互接近且消除了不同数据集带来的影响。

CCA&PCA

另一种方法即mnnCorrect，最早用于计算机领域图形识别。该法寻找不同数据集间最接近的细胞，将之判定为潜在的状态相同细胞，随后利用成对MNNs距离计算一个批次参数（batch vector），用以校正原始表达矩阵（Haghverdi, L., 2018）。

MNNs原理

CCA/mnnCorrect在整合处理不同来源的scRNA-seq数据时表现良好。这将极大提升发现稀有细胞、微弱转录差异细胞及与之对应maker的能力（Haghverdi, L, et al,.2018； Butler, A,et al,. 2018） 。这为建立一个统一的单细胞参考数据集提供了依据。在此基础上，scRNA-seq数据整合分析得到了快速发展（Hie, B. L, et al., 2018; Barkas, N. et al., 2018; Park, J.-E., 2018; Korsunsky, I. et al., 2018; Stuart, T. et al., 2018; Welch, J. et al., 2018）。这种多数据集整合分析的应用远不止用于校正批次效应这么单一。它可以在单细胞尺度上深入比较细胞间的状态，发现细胞对环境及基因扰动的特异性响应，对不同疾病及不同治疗下的患者的测序数据进行标准化。
scRNA-seq数据整合分析还可以扩展至跨物种分析。Karaiskos,N比较了两种果蝇早期胚胎的空间基因表达模式，通过构建空间基因表达图谱，该研究系统比较了两个果蝇的同源基因表达谱，鉴定出了彼此间的进化波动。Tosches比较了爬行动物与哺乳动物脑细胞间的相关性。Baron分析了人与小鼠胰岛细胞scRNA-seq数据，鉴定出了二者间的保守亚群。Alpert开发出了cellAlign，在一维水平上比对了人与小鼠的拟时轨迹，发现人胚胎合子激活要比小鼠晚，小鼠中比人活跃的基因皆与蛋白合成相关。跨物种分析未来是光明的，但对于多物种整合分析而言，精确鉴定物种间同源基因是多物种整合分析至关重要的一步。

2.2 多重scRNA-seq数据集间的细胞分类

以细胞分类信息的形式串联不同的scRNA-seq数据集，或者借鉴到自己实验中，是优于合并数据集然后de novo聚类这种方法的。且随着有参细胞图谱的开发，这种方式将更加寻常。目前已开发对应方法：scmap- cell & scmap- cluster，其中scmap-cell 用乘积量化（product quantization）算法进行比对，而scmap-cluster则用于识别未知数据集中的cluster。

有参与denovo细胞聚类概图

利用已有的注释数据集，目前开发的新方法采用奇异值分解、线性判别分析和支持向量机算法来对细胞进行分类。此外，随着引用数据集的大小、范围与深度越来越高，监督聚类在解析细胞类型方面要比无监督聚类强得多。通过以上这些方法，可以更精确地识别并解析细胞亚群。

2.3 不同来源和类型的单细胞数据整合分析

satija已有相关文章研究：Comprehensive Integration of Single-Cell Data
这一部分讲的是将scRNA-seq数据与其它不同来源和类型数据诸如甲基化、染色质结构等整合分析的方法。
将scRNA-seq数据与其它类型、不同来源的单细胞数据整合分析是无法提取到数据间的共同特征的，因为它们不是一个类型的数据，需要不同的分析方法。这点在基于基因组的数据（如染色质可及性与甲基化数据）与基于基因的数据（如基因与蛋白表达数据）间整合分析尤为明显。但如果这些数据来自于同一类细胞群，由于存在着共同的生物学状态，此时可以联立分析以发现不同数据集类型间的对应关系。

MATCHER是一种在一维水平上比较不同类型测序数据拟时轨迹的方法。简单来说就是比对不同类型测序数据的拟时轨迹，以确定这些数据集间的对应关系。这种方法可以识别不同数据集间的“等效细胞”而不需预先知道彼此间的对应关系。开发者用scM&T- seq（Angermueller, C. et al., 2016）和scRNA-seq数据做了验证，准确预测了DNA甲基化与基因表达之间的关系。
其他sc-seq数据不同于scRNA-seq数据一样可以借助Marker解析细胞类型，因此可以利用scRNA-seq解析出的细胞信息为其他sc-seq数据分析做参考。有研究（ Lake, B. B. et al., 2018）对不同脑组织切片进行了单核RNAseq（snRNA-seq）与单细胞转座子超敏性位点测序（scTHS-seq），通过梯度推进算法利用单细胞基因表达谱指导了染色质可及性测序数据集的细胞分类：作者首先鉴别出snRNA-seq数据集与scTHS-seq数据集共有的细胞亚群，训练一个可以将基因表达与染色质可及性数据关联的模型；然后利用该模型去分类scTHS-seq中剩余未被分类的细胞。这种方法可以更细致地对大脑组织中的细胞进行分类。同样，可以整合scATAC-seq数据集来分析单细胞DNA甲基化或转座酶染色质可及性间的细胞分类。
目前正在开发的新方法有利用假定等价特征、或识别在所有类型数据中的假定相关共享特征来进行数据交叉模态分类。 Welch开发了一种集成非负矩阵分解（iNMF）的方法，名为LIGER，可以跨模态整合数据。他们对同一类型皮质细胞分别进行了亚硫酸盐测序（snmC- seq）与scRNA-seq并对其进行了分类。他们假设基因体甲基化与其表达水平负相关从而整合了不同模态测序数据进行细胞分类。在seurat v3.0中，作者也引入了假定等价特征或关联特征进行多模态整合数据细胞分类的方法。这些方法优点如上所述，即可以利用scRNA-seq的细胞分类信息来指导scATAC-seq数据细胞分类，鉴别出染色质可及性与DNA甲基化的细胞特异模块。

2.4空间数据与测序数据整合

组织中细胞的空间结构常反映出细胞间的功能差异与细胞命运和谱系的差异。不同基因表达引导细胞向不同方向分化，不同细胞精确排列形成不同组织。关键是单细胞实验通常在分析前细胞已被解离，组织原位信息无法保留，scRNA-seq得到的表达谱不能完全反应细胞空间信息。具有相似基因表达谱的细胞可能存在于不同的空间位置中，故而细胞分离过程中空间信息的缺失是很多单细胞实验的主要缺点。结合高分辨率基因表达谱与空间表达图谱 (spatial expression maps) 将细胞空间坐标与基因表达谱联系起来，可以解决这一问题。有两类方法：计算模型或者RNA原位定量，可以同时收集到细胞空间坐标与基因表达值。

scRNA-seq+spatial expression maps
FISH方法是原位基因检验的金标准，但是它检测基因数目较少。新方法将探针与纠错码相结合，可以一次性检测到数百个基因表达情况，或使用空间条形码来记录mRNA逆转录过程中的空间信息。这些数据集可以通过计算方法进行整合，同时获取高通量的空间信息与基因表达信息。
目前计算整合FISH与scRNA-seq数据已有相关文章报道。这个思路最初由Satija和Achim提出，应用于脑组织研究中，后来扩展到其他组织研究中，为个体本身提供了完整的空间表达图谱。该类研究通常关注关键基因的空间分布，获取它们的空间表达模式，并为单个基因建立对应表达模型，利用这些空间表达模型，将单细胞数据mapping到空间信息中。藉由该方法得到的整合数据集，可以研究几乎所有基因的空间轮廓，进而研究每种细胞所在区域情况。
细胞空间邻域研究
预测scRNA-seq基因表达位置
目前最新的方法可以从该类整合数据中系统分析基因空间表达趋势。但是该类方法只适用于已有明晰空间结构的组织或个体，如早期胚胎与动物肝脏；在成熟个体或实体肿瘤应用仍不现实。一些研究提出了一种粗整合方案：scRNA-seq鉴定细胞簇marker基因后，用FISH或免疫组化检测一小部分感兴趣基因，将之与scRNA-seq相整合。但是此类研究较为粗糙，并未提供系统的解决方案 (Puram, S. V. et al., 2017；Pandey, S. et al., 2018)。
近年来，有两种高分辨率的空间基因表达测定方法被开发出来，可以检测大范围2D或3D组织内单个细胞数十至数百基因表达情况（Wang, X. et al., 2018；Codeluppi, S. et al., 2018）。这些方法极大降低了组织背景荧光，提高了信噪比。这两种方法（osmFISH&STARmap）均可以保有组织原位三维空间信息。这些方法可以原位获取许多细胞和基因的精确表达谱，可以在细胞原位进行分子分型，评估细胞分布环境，推断细胞各类细胞的三维分布，将细胞信息推到解剖学水平上去。空间数据与scRNA-seq数据整合，可以为研究组织构成与功能提供全新的手段。

3. 展望

随着单细胞技术日趋成熟，每个细胞所检测的测量量与检测到的细胞和分子数量都在逐渐增加。因此整合不同实验得到的不同模态数据成为必然。目前正在进行的人类细胞图谱和关键模式生物图谱是当下最大规模的多模态数据整合工作。整合单细胞一系列多模态数据，我们可以获取转录组之上的细胞图谱，洞悉细胞的整体状态。分析单细胞多模态数据之间的关系，可以揭示细胞功能的潜在基础，推断各模态间的因果关系。

生物学中有一个主要问题：什么是细胞类型？

解决方案正如那个 老问题：“什么是基因？” 的答案一般，该问题是通过跨物种DNA序列比较与多种模式下的生化分析来解答的。故而本问题的答案必是在多种模式与条件下，对单细胞进行细致分析来回答。