比较转录组学分析揭示了凡纳滨对虾热应激的能量重新分配网络
一、导读
温度是生态系统中一个重要的环境因素。了解动物各组织对热应激反应的协同作用，是阐明不同物种在热应激下的调控机制的基础。
本研究对太平洋白虾—凡纳滨对虾的三种组织（肝胰腺、鳃和肌肉）进行了比较转录组学分析。结果显示，三个组织显示出不同的基因表达模式，表明它们之间可能存在基于劳动分工的合作。在肝胰腺和鳃中，与ATP生成和利用相关的基因被下调，并且能量蛋白质周转几乎被关闭。在肌肉中，与ATP生成和利用相关的基因，以及涉及几个能量消耗过程的基因被上调。同样的，在肝胰腺和鳃中检测到ATP的显著积累和总蛋白浓度的降低，而在肌肉中则相反。因此，研究者认为不同组织可以通过能量重新分配同时相互合作以应对热应激。较少的能量被引导到鳃和肝胰腺中的蛋白质周转，而肌肉需要更多的能量。本研究不仅为凡纳滨对虾响应高温的分子机制提供了全面的认识，而且为挖掘耐热基因和提出应对高温环境的有效策略奠定了基础。
原名：Comparative transcriptomic analysis unveils a network of energy reallocation in Litopenaeus vannamei responsive to heat-stress
译名：比较转录组学分析揭示了凡纳滨对虾热应激的能量重新分配网络
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：6.291
发表时间：2022年5月
通讯作者：张晓军，李富花
通讯作者单位：中国科学院海洋研究所
二、实验设计
三、结果
1. 转录组数据
在本研究中，研究者从18个测序文库中获得了842636398个raw reads（表S2）。每个文库的Q30从93.26%到95.15%不等，表明转录组数据质量很高。所有raw reads均已保存在NCBI序列读数存档(SRA)网站中（登录号：PRJNA798779）。基于这些测序数据，计算每个基因的表达水平。为了验证RNA-Seq的定量结果，通过RT-qPCR确认了三个组织中5个基因的相对表达水平。正如预期的那样，qPCR显示的倍数变化与RNA-Seq分析的结果一致（表S3），表明RNA-Seq结果的可靠性和准确性。
此外，无论温度如何，PCA图中显示了不同组织中样品的清晰分离(图S1A)。肝胰腺组、鳃组和肌肉组的Pearson相关系数值分别大于0.84、0.74、0.98(图S1B)。这一结果推断出不同的组织暗示着不同的策略，并可能相互合作以应对热应激。
表1 热冲击下凡纳滨对虾三种组织中常见的带注释的DEG。
图1.热应激下凡纳滨对虾三个组织中转录组DEG。(A)三个组织中的DEG数目。(B)三种组织中DEGs的韦恩图。(C)正常条件下三种组织中所有DEGs的表达谱。选择在热应激下至少在一个组织中差异表达的所有基因用于构建该热图
2. 热应激下三种组织中的DEGs
本研究共鉴定出2488个DEG，分别包括1209个上调基因和1279个下调基因（图1A）。然而，不同组织之间的DEG数量差异很大。详细地说，鳃组在三种组织中含有最多的DEG，而在肌肉中发现的DEG最少（图1A）。此外，韦恩图显示三个组织之间共享的DEG较少（图1B）。此外，这些DEGs的表达谱在正常条件下显示出三种组织之间的明显差异（图1C）。详细而言，鳃和肝胰腺共有109个DEG，分别仅占鳃和肝胰腺总DEG的8.37%和14.42%。鳃和肌肉共享62个DEG，肌肉和肝胰腺仅共享36个DEG。这些结果进一步证实了独特的反应在不同组织中对热应激的反应占主导地位。23个DEG相交，在三个组织中表现出上调（图1B，表1，表S4），表明它们在热应激中的重要和保守作用。值得注意的是，其中6个基因，分别注释为血细胞稳态相关蛋白(HHAP)、RNA聚合酶II转录亚基15样异构体X3(MED15X3)、热休克蛋白21(HSP21)、MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(MKNK1)和丝氨酸蛋白酶抑制剂B3(表1)，被报道与应激反应有关。
图2.热应激对凡纳滨对虾鳃的影响。(A)鳃中KEGG富集分析的途径。圆圈大小和颜色分别代表相应通路的DEG数和Q值。(B)热应激下鳃“谷胱甘肽代谢途径”的表达变化。红色和蓝色分别代表上调和下调的基因。热图的红色和白色矩形分别代表对照组和热应激组中相应的基因表达。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参考本文的网络版本。）
3. 鳃中DEGs的功能分析
在鳃中，共有1302个DEG在热应激下被表征，包括527个上调基因和775个下调基因（图1A）。4条KEGG通路显著富集（Q＜0.05）（图2A）。其中，“谷胱甘肽代谢”（ko00480，24个基因）是主要途径（图2A），包括4个GST和2个GPX基因的上调，15个氨基肽酶（ANPEP）和异柠檬酸脱氢酶（IDH）基因下调。(图2B)。此外，15个ANPEP基因在热应激后的表达几乎为零（图2B），其中4个根据倍数变化属于top20下调基因，表明通过甘氨酸产生还原型谷胱甘肽（GSH）受到很大阻碍.连同3个SOD基因的上调，这些结果表明抗氧化系统得到了加强，以应对高温条件下过量的ROS。同时，在热应激后观察到广谱免疫相关基因的显著转录变化，例如，5个甲壳素家族成员、7个C型凝集素、3个前酚氧化酶及相关基因、3个α-2-巨球蛋白、2个抗-脂多糖因子（ALF）、2个半胱天冬酶、许多丝氨酸蛋白酶/蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂（表S5）。这些结果表明，热应激明显影响虾的免疫功能。
此外，“代谢途径”（ko01100，98个基因），包括35个上调基因和63个下调基因也显著富集。其中，参与“聚糖生物合成与代谢”（27个DEGs，24个下调基因和3个上调基因）和“氨基酸代谢”（45个DEGs，31个下调基因和14个上调基因）的DEGs最多，且表现出下调，表明它们受到热应激的抑制。此外，大多数DEG在“内质网蛋白质加工”（ko04141，21个基因）途径中的表达下调，虽然它没有显著富集（P=0.006，Q=0.0754）（图2A），表明蛋白质合成在热应激下的鳃中也受到一定程度的阻碍。
图3.热应激对凡纳滨对虾三种组织蛋白质转换的影响。(A)肝胰腺中KEGG富集分析的途径。圆圈大小和颜色分别代表相应通路的DEG数和Q值。(B)示意图显示了虾在热应激下蛋白质周转相关基因的表达变化。每个星形、正方形和圆形分别代表鳃、肝胰腺和肌肉的DEG。红色和蓝色代表上调和下调的DEG。ARS代表氨酰tRNA合成酶。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参考本文的网络版本。）
4. 肝胰腺中DEGs的功能分析
在肝胰腺中，热应激下共鉴定出756个DEG，包括358个上调基因和398个下调基因（图1A）。3条途径显著富集（Q值＜0.05），包括“蛋白酶体”（ko03050，11个基因）、“真核生物中的核糖体生物发生”（ko03008，12个基因）和“氨酰-tRNA生物合成”（ko00970，9个基因）（图3A)，与蛋白质周转有关(图3B)。这3条途径主要包括分别编码蛋白酶体、核仁蛋白（nop1、nop56和nop58）和tRNA连接酶（也称为tRNA合成酶）单位的下调基因。此外，大多数属于转录和翻译类别的DEG也表现出显著的下调，例如一般转录因子和翻译起始因子（图3B，表S6）。这些结果表明，热应激下肝胰腺中的蛋白质周转明显停滞。
图4.热应激对凡纳滨对虾肌肉的影响。(A)肌肉中KEGG富集分析的途径。圆圈大小和颜色分别代表相应通路的DEG数和Q值。(B)胁迫下肌肉中DEG的PPI网络。圆圈大小代表节点的程度。红色和蓝色代表上调和下调的调节基因。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参考本文的网络版本。）
5. 肌肉中DEGs的功能分析和网络构建
在肌肉中，在热应激下共鉴定出430个DEG，包括324个上调基因和106个下调基因（图1A）。热休克蛋白（HSPs）和HSP相关基因74个，占上调基因总数的22.8%。然而，尽管8条KEGG通路显著富集，但HSP主要在这些通路中注释（图4A）。比如top3富集的通路，分别是“内质网蛋白加工”（ko04141，47个基因）、“长寿调节通路-多物种”（ko04213，34个基因）和“雌激素信号通路”（ko04915，10个基因），分别包括39个(83%)、28个(82%)和8个(80%)HSP或HSP相关基因。此外，HSPs占据了关键位置，允许它们在网络中的基因数量和节点度数（图4B）。这些结果表明热休克蛋白在肌肉热应激反应中的核心作用。此外，几乎所有参与转录、转录后修饰和翻译的DEG在热应激下均显著上调（表2）。
表2.热应激下虾肌肉转录、转录后修饰和翻译的DEGs。
图5.(A)在虾的三种组织中参与几种能量产生途径（糖酵解和TCA循环）的基因的表达谱。三重矩形中的值分别定义为虾鳃、肝胰腺和肌肉（从左到右）在热应激下的表达倍数变化。箭头代表相应过程的酶。酶的缩写：HK，己糖激酶；GPI，葡萄糖-6-磷酸异构酶；PFK，6-磷酸果糖激酶；ALDO，果糖二磷酸醛缩酶；GAPDH，甘油醛3-磷酸脱氢酶；PGK，磷酸甘油酸激酶；PGM，磷酸甘油酸变位酶；ENO，烯醇化酶；PK，丙酮酸激酶；LDH，乳酸脱氢酶；PDH，丙酮酸脱氢酶；DLAT，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶；CS，柠檬酸合酶；ACO，乌头水合酶；IDH，异柠檬酸脱氢酶；OGDC，α-酮戊二酸脱氢酶；SCS，琥珀酰辅酶A合成酶β亚基；SDH，琥珀酸脱氢酶；FUM，富马酸水合酶；MDH，苹果酸脱氢酶；ACLY,ATP柠檬酸盐(pro-S)-裂解酶。(B-D)ATP合成酶和ATP酶分别在鳃、肝胰腺和肌肉中的表达谱。矩形中的值代表3个重复的平均FPKM值。对照和热应激样品中FPKM值低于1的基因被认为是低表达基因并被去除。(E)热应激下三种组织中总蛋白浓度的变化。各时间点不同字母的均值有显著差异（P＜0.05）。(F)热应激下三种组织中ATP浓度的变化。各时间点不同字母的均值有显著差异（P＜0.05）
6. 热胁迫下虾的能量产生与利用
考虑到上述三种组织的主要变化都与能量有关，提示能量代谢在虾应对热应激时具有潜在的作用。因此，本研究分析了ATP的产生和利用。
鳃：在鳃中，与TCA循环相关的75%基因（8个中的6个）（图5A）和93.3% ATP合酶（15个中的14个）的下调表达暗示了热休克下ATP合成的抑制（图5B，表S7)。此外，73.1% ATPases的下调（52个中的38个）显示ATP利用率受到抑制。然而，大多数参与糖酵解的基因表现出上调。在这种情况下，ATP浓度显著增加（P＜0.05），例如，与对照组相比，12小时组ATP浓度增加了2.8倍（图5F）。然而，所有组之间的总蛋白浓度没有明显差异（P＞0.05）（图5E）。这些结果表明，热应激阻碍了鳃中能量的产生和利用。
肝胰腺：类似地，肝胰腺中的能量产生和利用也受到阻碍，这被所有表达的ATP合酶和74.6%表达的ATP酶（59个中的44个）的下调所证实（图5C，表S8）。此外，除烯醇化酶外，所有参与糖酵解和TCA循环的基因都在一定程度上下调（图5A），这也证明了ATP产生的抑制。在这种情况下，ATP浓度也显著增加（P＜0.05），例如，与对照组相比，6小时组虾的ATP浓度增加了5.04倍（图5F）。相反，热应激组的总蛋白浓度在24小时内显著下降（P＜0.05），例如，24小时总蛋白浓度下降了49.7%（图5E）。
肌肉：与肝胰腺和鳃不同，所有表达的ATP合酶都表现出上调，肌肉中仅65.5%的表达ATP酶（29个中的19个）如此（图5D，表S9）。此外，参与TCA循环的9个基因中有8个表现出上调，其中2个，即乌头酸水合酶和富马酸水合酶显著上调（图5A）。正如预期的那样，在整个热应激期间，所有应激组的ATP浓度均显著下降（P＜0.05），例如，与对照组相比，24小时组的ATP浓度下降了7.22倍（图5F）。这些结果表明，肌肉中的能量产生和利用得到了加速。相反，应激组的总蛋白浓度显著低于对照组（P＜0.05）。例如，在高温胁迫2小时后，总蛋白质浓度从0.116g/g显著增加至0.167g/g（图5E）。
四、讨论
本研究中，研究者在热应激（33℃）下的凡纳滨对虾肝胰腺、鳃和肌肉中分别鉴定到了746、1302和430个DEG。同时，三个组织之间共享的DEGs很少但功能富集结果相似，这表明在这些不同组织中对热应激的反应机制是不同的但具有连接性。此外，研究者通过比较转录组分析证明了虾的不同组织在应对热应激时的分工和分工。本研究提供了对虾和其他变温动物响应环境压力的调节机制的见解。
1 鳃细胞转化为无氧呼吸，应对热应激引起的氧化应激
高温通常会加速摄氧量和呼吸速率，从而产生过量的活性氧并导致甲壳类动物发生氧化应激。通常，水生动物利用抗氧化系统，主要包括GSH/GSSG和抗氧化酶，以清除过量的ROS，以免破坏核酸和蛋白质的结构和功能以适应环境。在本研究中，谷胱甘肽代谢是热应激下鳃中的主要富集途径（图2A）。GST、GPX、ANPEP和IDH基因的转录调控会降低GSH但增加GSSG滴度，降低的GSH/GSSG比率加速了ROS的消除，以及3个SOD基因的上调，在之前的研究中也发现了类似的结果。同时，过量的活性氧也会导致免疫系统的反应。据报道，急性热应激会降低或扰乱凡纳滨对虾的免疫能力，并在短时间内降低对病原体的抵抗力。它是由鳃中许多免疫分子的抑制引起的，如甲壳素、ALF、PPAE、酚氧化酶原、C型凝集素等，这些在本研究中也受到显著调控。经过一段时间的免疫调节，对虾会建立起免疫适应性。
此外，高温不仅会降低水中的溶解氧，还会破坏鳃的结构，降低其气体交换能力。因此，高温通常伴随着缺氧应激。在本研究中，HIF-1通路的激活（图2A，表S10）表明虾鳃明显将有氧呼吸转化为无氧呼吸，乳酸脱氢酶（无氧呼吸的指标）的上调进一步证明了这一点并抑制TCA循环。始终如一地，三羧酸循环和呼吸链受到抑制，ATP生成率随着温度的升高分别在日本长吻鲈和锯缘青蟹的鳃中下降。在这种情况下，上调的糖酵解推断由增加的摄氧量引起的无氧代谢增强。然而，这些结果并不能解释ATP的积累，尤其是当ATP合酶的表达下调时。考虑到内质网中多糖生物合成、氨基酸代谢和蛋白质加工等能量消耗过程的抑制，ATP浓度的增加可能是由于能量消耗减少所致，这可以通过ATP酶的下调来证明。
2 肝胰腺中蛋白质周转的全面关闭节省了能量
一般来说，热应激会影响无脊椎动物的整体蛋白质转换，这是指蛋白质合成和蛋白质降解的过程。在本研究中，蛋白质降解受到阻碍，这以抑制的蛋白酶体途径为代表。此外，作为蛋白水解酶，几种丝氨酸蛋白酶/蛋白酶和胰蛋白酶的下调也支持了这一结论。然而，关于高温对蛋白质降解影响的研究产生了不同的结果。热应激促使蛋白质降解以选择性降解瓷蟹中错误折叠或变性的蛋白质，但会损害哺乳动物细胞中26S蛋白酶体的活化。本研究支持后一种结果。更重要的是，蛋白质合成也通过即将发生的核糖体生物合成、氨酰-tRNA生物合成和ER通路中的蛋白质加工而整体关闭。前2个通路参与从mRNA到多肽的翻译过程，最后一个通路负责加工新合成的多肽。同样，已发现高温会抑制许多物种的蛋白质合成。在本项研究中，蛋白质合成过程的抑制导致总蛋白质浓度显著降低。它进一步导致能量消耗显著减少，因为蛋白质合成是细胞中主要的能量消耗过程。另一方面，ATP酶的下调进一步证实了这一推测。在这种情况下，ATP的积累表明肝胰腺细胞的能量需求较低，这由下调的糖酵解、TCA循环和ATP合酶证实。一致地，在高温下，P.cinctipes*和斑节对虾的肝胰腺中ATP合成酶的活性下降并且ATP含量显著增加。然而，以往的研究推测，高温加速了ATP的合成，这说明了ATP含量的积累，但能量消耗可能会被忽略。
3 大量诱导热休克蛋白在肌肉中消耗大量能量
HSPs的大量产生是热应激下甲壳类动物最主要的特征之一。作为典型的分子伴侣，HSPs用于保护蛋白质免于聚集，通过重折叠变性蛋白质或以ATP依赖性方式降解热应激诱导的错误折叠蛋白质。在本研究中，在肌肉中观察到HSP21、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90的强烈诱导，这与之前的研究一致。考虑到HSP在肌肉中的主要作用，伴随的转录和翻译过程大大加强了它们的生成。这些影响导致总蛋白质浓度显著增加，再加上HSP的伴侣功能依赖于ATP，上述变化的发生会消耗大量能量，这由ATP减少证实。结合上调的TCA循环、ATP合酶和ATP酶，这些结果表明肌肉细胞处于高能量需求状态。同样，高温条件下三疣梭子蟹肌肉中的ATP浓度和腺苷酸能量电荷(AEC)均升高，证实了甲壳类动物应对热应激时肌肉的高能量需求是必不可少的。
图6.三种组织在热应激下的单独反应和能量重新分配示意图。红色和蓝色矩形或箭头代表上调和下调的生物过程）
4 更多的能量被重新分配到三个组织之间的热保护中
在最佳环境条件下，能量供应足以支付所有体细胞维持成本，此外它还允许能量储备的生长、繁殖和积累。然而，维护优先于压力保护和确保生存，而重新分配的能量通量导致能量利用效率的整体下降，如生长停滞、繁殖暂停和能量储存在压力环境下的动员。根据DEB规则，本研究中采样的虾一般在 pejus 范围和 pessimum 范围之间。热休克蛋白和抗氧化剂在前一阶段大量产生，部分厌氧被激活，许多需要ATP的功能（例如蛋白质合成）被关闭，以确保在后一阶段立即存活的能量平衡。然而，三种组织在热应激下的能量需求状态不同。具体而言，鳃和肝胰腺处于低能量需求状态，能量产生和利用均处于低水平。然而，肌肉中的情况则完全相反，能量产生和利用过程都加速了，这表明肌肉处于高能量需求状态，可以合理地假设这种现象是由于不同组织之间能量通量的重新分配。也就是说，较少的能量被引导到鳃和肝胰腺中能量昂贵的蛋白质周转以最小程度地维持生命，更多的能量被重新分配给在高温条件下的肌肉中的热保护和鳃中的抗氧化系统（图6）。显著不同的是，在本研究中仅在肌肉而不是肝胰腺和鳃中观察到HSP的诱导，这可以解释为HSP在保护肌肉组成蛋白（如肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白）免受热诱导聚集方面发挥着至关重要的作用。但这三个组织如何相互协调仍然未知，也许神经系统在这个综合调节过程中发挥了重要作用。
结论
为了研究虾对热应激反应的分子机制，本研究对凡纳滨对虾三种组织进行了比较转录组学分析。在肝胰腺和鳃中，能量昂贵的蛋白质周转几乎被关闭以节省能量。虽然在肌肉中产生了大量能量并为HSP的广泛转录和翻译提供燃料。总的来说，这些结果表明较少的能量被引导到肝胰腺中的蛋白质转换，而更多的能量被分配到虾肌肉的应激反应中。这些结果将促进对凡纳滨对虾热应激反应的分子机制的理解。
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