omicshare富集分析

数据准备：
明白了GO富集的原理后，我们需要准备的数据就只有两份：前景基因文件和背景基因文件。
富集目的基因文件（前景基因文件）：就是你要富集分析的基因集。在上面的例子中，就是对照组vs处理组的差异表达基因。格式为每行一个基因ID，文本文件（制表符分隔）（*.txt）。

GO背景基因文件：就是所有的基因集，在上面的例子中，就是对照组和处理组所有的表达基因。
1）如果你研究的物种是有参考基因组的模式物种，那么可以直接使用数据库上已有的参考基因作为背景基因文件。目前提供的物种有水稻、拟南芥、小鼠、大鼠、斑马鱼、鸡、秀丽线虫、果蝇、人。ID类型可选择基因ID或转录本ID，根据富集目的基因的ID类型决定。如果不清楚自己的文件是什么ID，可以点击“预览参考文件”来查看具体ID。后面的“版本”是最新的Ensemble版本号。

2）如果你研究的物种不在这些选择范围内，那么就要自己准备GO背景基因文件了。
因为一个基因可有多个GO term，所以文件格式有两种：一种为第一列为基因ID，第二列为所对应的GO term，如下表：

另一种为第一列是基因ID，第二列之后为同一个基因的所有GO号，这种格式也是我们基迪奥的转录组denovo流程出来的结果格式，如下表：

上传这两种格式中的任何一种都是可以的~ 要记住，前景基因文件里的基因ID必须包含在背景基因文件里面！

如何得到基因的GO注释？
有一些同学不知道如何获得背景基因的GO号。通常，如果你的数据是从公司测序得到的，那么测序报告里都会有。如果你是自己捣腾的数据，那么，如果是无参考基因组的物种，就需要根据unigene的Nr注释，用Blast2go软件得到unigene的GO注释信息。具体Blast2go的使用，可参考我们第二期在线交流课堂：http://www.omicshare.com/forum/thread-176-1-1.html。如果是有参考基因组的物种，可以在GO 官网上下载GO注释信息，也可以在Biomart上下载物种的GO注释信息，我们也有相应的教程：http://www.omicshare.com/forum/thread-437-1-1.html。

上传完这两个文件后，点击“提交”就OK了。等着收菜~~

三、结果解读： 这次我试运行的数据为荔枝趋势分析文章里的趋势分析结果数据，我以profile1包含的基因为前景基因集，所有趋势包含的基因为背景基因集，做GO富集分析。
1. GO二级分类图（out.secLevel.png/svg）

这个图显示了profile1的基因在各个GO term的数目和富集情况。横坐标代表GO三个 ontology的更细一级分类，即二级分类；纵坐标代表每个分类条目所包含的基因数目。由于一个基因常常对应多个GO term，因此同一个基因会在不同分类条目下出现，即被多次统计，因此如果你把这里所有柱子的基因数目加起来，肯定是多于profiel1总的基因数目的。

2. GO富集结果表（out.[PFC].html ） 三个Ontology（C, F, P）会分别展示。以生物过程（biological process）为例子，如下表：
第一列为GO term的ID，点击GO ID，可显示这个GO term包含的所有基因：

再点击这个GO ID，就可以链接到 http://amigo.geneontology.org 官网，可以查看GO的具体信息。

第二列为GO term的功能描述；

第三列前面的数字为差异表达基因中富集到这个GO term的基因数，后面的数字为差异表达基因的总数；

第四列前面的数字为背景基因中富集到这个GO term的基因数，后面的数字为背景基因的总数；

第五列为P value，即计算第三列的百分比与第四列的百分比相比，是否有显著差异。我们将小于0.05的P value标红显示；

第六列为多重检验校正后的Q value，也是把小于0.05的Q value标红显示。这些GO term是按照P value从小到大排列的，方便老师找差异富集结果。如在这个例子中， microtubule-based process为在差异基因中富集最显著的GO term，说明profile1中的基因显著富集于这个功能。

3. GO有向无环图（out.C/P/F.png）

   从整体上来看，GO注释系统是一个有向无环图 (Directed Acyclic Graphs)，GO各term之间的关系是单向的，GO term之间的分类关系有三种：is a、part of 和 regulates。具体的解释可看这个帖子： http://www.omicshare.com/forum/thread-538-1-1.html。富集分析结果会分别给出GO三个ontology（细胞组分、分子功能、生物过程）的有向无环图，如下图是生物过程的有向无环图：

在这个图中，越接近根结点的GO term越概括，往下分支的GO term为注释到更细层级的term。我们来看每个GO term里的含义：

其中，Pvalue 这一行，如果大于0.05，即会显示NA，即图中只显示显著的P value。

形状的含义：程序默认把显著性最高的前10个GO term设置为方形，其他的GO term为圆形。

颜色的含义：颜色越深，代表该GO term越显著。颜色由浅到深分别为：无色——浅黄——深黄——红色。

那么，从颜色上来看，在molecular function这个ontology上，最显著的GO term是GO:0003774。因此后续可以从这个GO term入手，这个GO term所在的分支上的其他GO term也值得研究。

意义：

GO有向无环图展示了GO term之间的分类关系，并且从另一方面帮助老师寻找显著富集的GO term。

四、引用

大家如果在数据处理的过程中，使用了我们的omicshare tools云工具网站，那么在文章中的method部分可以这样引用： GO enrichment analysis was performed using the OmicShare tools,a free online platform for data analysis (www.omicshare.com/tools)。