常用的分析方法：

• 过表征分析 (over representation analysis, ORA) ：先找出差异基因，再对差异基因进行如GO/KEGG等富集
• 基因富集分析 (gene set enrichment analysis, GSEA)：对所有的基因进行富集，综合考虑每一个基因对于基因集的贡献

GO是基因本体论联合会建立的一个数据库，旨在建立一个适用于各种物种的、对基因和蛋白功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO注释分为三大类，分别是：分子生物学功能（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）和细胞学组分（Cellular Components，CC），通过这三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。

KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库。KEGG下属4个大类和17和子数据库，其中KEGG Pathway数据库最为常用。

1 GO Analysis

clusterProfiler 包中的 enrichGO() 可以对差异基因进行GO分析

• 流程：差异基因 -- > 基因ID转换 -- > GO富集 -- > 结果可视化
• 需要文件：DGE分析后筛选出的基因

1.1 GO-基因ID的转换

常用ID：

1. Ensemble：欧洲生物信息数据库提供 ENSG+11位数字
2. Entrez：NCBI提供，纯数字
3. Symbol：常用基因名
4. Refseq：NCBI提供的参考序列数据，以NG/NM等开头

建议使用 ENTREZID 格式的ID进行GO分析，可通过bitr()函数转换基因ID
bitr(geneID, fromType="", toType="", OrgDb=, drop=TRUE)
geneID: 需要转换的基因ID文件；fromType：geneID文件中的ID类型；toType：输出的ID类型； OrgDb：注释对象； Drop：是否去除空值

e.g. 以DOSE包中的数据geneList 为例

> data(geneList, package="DOSE")
> head(geneList)
    4312     8318    10874    55143    55388      991 
4.572613 4.514594 4.418218 4.144075 3.876258 3.677857 

#选取差异基因
> gene <- names(geneList)[abs(geneList) >2]

# 转换ID
> geneID <- bitr(gene, fromType = "ENTREZID", 
+                 toType = c("ENSEMBL", "SYMBOL"),
+                 OrgDb = org.Hs.eg.db) 
> head(geneID)
  ENTREZID         ENSEMBL SYMBOL
1     4312 ENSG00000196611   MMP1
2     8318 ENSG00000093009  CDC45
3    10874 ENSG00000109255    NMU
4    55143 ENSG00000134690  CDCA8
5    55388 ENSG00000065328  MCM10
6      991 ENSG00000117399  CDC20

# keytypes(org.Hs.eg.db) 可查询人类基因注释包中支持的ID类型

1.2 GO-GO富集分析

enrichGO()函数对差异基因进行GO富集分析

> gene.GO <- enrichGO(gene = geneID$ENTREZID,
                    OrgDb = org.Hs.eg.db,
                    keyType = "ENTREZID",
                    ont = "CC",
                    pAdjustMethod = "BH",
                    pvalueCutoff = 0.01,
                    qvalueCutoff = 0.05,
                    readable = T)
> gene.GO[1:2,]
                   ID     Description GeneRatio   BgRatio
GO:0005819 GO:0005819         spindle    25/200 347/19717
GO:0072686 GO:0072686 mitotic spindle    15/200 109/19717
                 pvalue     p.adjust       qvalue
GO:0005819 1.612727e-14 4.951071e-12 4.498659e-12
GO:0072686 3.213034e-13 4.932007e-11 4.481337e-11
                                                                                                                                                        geneID
GO:0005819 CDCA8/CDC20/KIF23/CENPE/ASPM/DLGAP5/SKA1/NUSAP1/TPX2/TACC3/NEK2/CDK1/MAD2L1/KIF18A/BIRC5/KIF11/TTK/AURKB/PRC1/KIFC1/KIF18B/KIF20A/AURKA/CCNB1/KIF4A
GO:0072686                                                           KIF23/CENPE/ASPM/SKA1/NUSAP1/TPX2/TACC3/CDK1/MAD2L1/KIF18A/KIF11/AURKB/KIFC1/KIF18B/AURKA
           Count
GO:0005819    25
GO:0072686    15

# 可保存生成的 @result 文件 
> write.table(gene.GO@result, file = "geneGO.txt", 
              sep = "\t", row.names = T,col.names = T)

• 参数：
  gene差异基因；keyType指定基因ID的类型，默认为ENTREZID；OrgDb指定该物种对应的org包的名字；ont代表GO的3大类别，BP, CC, MF; pAdjustMethod指定多重假设检验矫正的方法；cufoff指定对应的阈值；readable=TRUE将基因ID转换为gene symbol；universe背景基因，若不指定，可使用数据库中所有基因作为背景

2 KEGG Analysis

流程与GO类似，将函数 enrichGO() 改为 enrichKEGG() 即可
使用参数organism 指定物种，需要查找物种对应的 kegg_code

e.g. 以DOSE包中的数据geneList 为例

> search_kegg_organism("human", by="common_name")
    kegg_code            scientific_name      common_name
1         hsa               Homo sapiens            human
115       phu Pediculus humanus corporis human body louse

> gene.KEGG <- enrichKEGG(gene = geneID$ENTREZID,
                        organism = "hsa",
                        keyType = "kegg",
                        pAdjustMethod = "BH",
                        pvalueCutoff = 0.01,
                        qvalueCutoff = 0.05 )

3 结果可视化

使用enrichplot 包进行富集结果可视化分析
可视化参考文章

• barplot / dotplot
• heatplot
• cnetplot
• emapplot
• goplot / plotGOgraph

3.1 barplot / dotplot

library(enrichplot)
p1 <- barplot(gene.GO, showCategory = 10)
p2 <- dotplot(gene.GO, showCategory = 10)
plot_grid(p1,p2,ncol = 2)

barplot/dotplot

3.2 heatplot

heatplot(gene.GO, foldChange = geneList)

heatmap

3.3 cnetplot

显示GO基因集中所富集到的基因，则将该基因与GO集连线

cnetplot(gene.GO, showCategory = 5)

cnetplot

3.4 emapplot

显示富集到的GO基因集之间的关系。若不同基因集见存在重叠基因，则基因集间将会连线

emapplot(gene.GO, showCategory = 20) 

emapplot

3.5 goplot / plotGOgraph

显示GO的有向无环图

goplot(gene.ID)

goplot