写在前面
这次分享一篇由上交的叶文秀老师近期发表在"PNAS" 的paper，“Stomatal immunity against fungal invasion comprises not only chitin-induced stomatal closure but also chitosan-induced guard cell death”，主要讲述了植物的气孔免疫由chitin诱导的气孔关闭和chitosan诱导的保卫细胞死亡构成。
名词解释
chitin oligosaccharide (CTOS) 我们常说的chitin。
chitosan oligosaccharide (CSOS)由几丁质脱乙酰酶将CTOS转换而成。
工作概述
CTOS通过其受体CERK1、Ca2+以及S型阴离子通道SLAC1介导的信号通路诱导气孔关闭。在真菌入侵时，真菌分泌的几丁质脱乙酰酶将CTOS转化为CSOS，但CSOS并没有导致气孔关闭，这表明这种转化是真菌逃避气孔关闭的策略。高浓度下的CSOS，而不是CTOS，会以一种依赖钙离子的方式诱导细胞死亡。综上，作者认为植物的气孔免疫由chitin诱导的气孔关闭和chitosan诱导的保卫细胞死亡构成。
试验结果
1.(GlcNAc)8 but Not (GlcN)8 Induces Stomatal Closure Mediated by CERK1.
分别用(GlcNAc)8和(GlcN)8去处理离体叶片，发现(GlcNAc)8能诱导气孔关闭，且存在剂量效应，而(GlcN)8却不能。
在cerk突变体中，(GlcNAc)8诱导的气孔关闭被破坏。而在回补突变体中却能恢复表型。尽管35S CERK1中CERK1的表达量是WT的20倍，但是对(GlcNAc)8的响应却和WT一致。
在cerk1-2突变体中外源施加1mM钙离子显著诱导了气孔关闭，说明cerk1-2突变体中气孔是有功能的。
2.(GlcNAc)8 Activates ICa Channels and Induces [Ca2+]cyt Elevations Mediated by CERK1 in Guard Cells.
在保卫细胞原生质体中，查明(GlcNAc)8对钙离子通道的效应，使用YC3.6做钙离子指示。(GlcNAc)8显著增加了Col-0中钙离子电流，并且被钙离子通道抑制剂La3+所破坏，并且这种激活在cerk1-2突变体中被破坏，在回补突变体中被恢复。这也就说明在拟南芥保卫细胞中(GlcNAc)8激活的钙离子通道由CERK1所介导。
(GlcNAc)8显著增加了WT中钙离子浓度瞬时增加的保卫细胞的数量，但不是cerk1-2中的(F3AB)。但是WT和cerk1-2中具有基本钙离子浓度的保卫细胞数量并没有差异。综上，这些结果说明(GlcNAc)8诱导拟南芥中保卫细胞的钙离子增加是依赖CERK1的。
3.(GlcNAc)8 Activates SLAC1 Mediated by CERK1 and Ca2+ in Guard Cells.
在响应生物刺激时，胞质钙离子浓度的增加对S类型的阴离子通道的激活是有必要的。
SLAC1作为保卫细胞中主要的S类型的阴离子通道，对于气孔关闭和S类型阴离子通道的激活是必要的。在slac1突变体中，(GlcNAc)8诱导的气孔关闭和S类型阴离子通道的激活被破坏，回补WT和磷酸化位点点突的突变体表型被恢复(F5A)。在双突中，(GlcNAc)8激活的S类型阴离子通道也被破坏(F5B-D)。并且敲除CPK6和OST1(可磷酸化SLAC1)也破坏了(GlcNAc)8诱导的气孔关闭(F5E)。这些结果说明，SLAC1和它在Ser59和Ser120的磷酸化对(GlcNAc)8诱导的气孔关闭是必要的，并且能激活S类型阴离子通道。
瞬时表达CERK1会诱导烟草细胞死亡，所以采用kinase-dead CERK1。蛋白互作验证得到，OST1特异性的与CERK1及其homologs互作。
在ABA突变体(abi1-1C和abi2-1C)中发现，(GlcNAc)8诱导的气孔关闭被抑制，说明(GlcNAc)8和ABA信号诱导的气孔关闭在type 2C 蛋白磷酸酶这里存在交联。
4.(GlcN)8 Induces Guard Cell Death in a Manner Dependent on Ca2+ but Not CERK1
(GlcN)8和(GlcNAc)8对保卫细胞的生存能力通过FDA染色查明。CTOS和mock并不显著影响保卫细胞的生存能力，但是CSOS处理却能使保卫细胞死亡，且存在剂量效应(F7A)。PI染色发现(GlcN)8诱导保卫细胞死亡，且在cerk1-2，lyk4和lyk5突变体中都存在，因此说明CERK1，LYK4和LYK5对于细胞死亡并不是必要的。
已知ROS和钙离子参与到刺激诱导的细胞死亡，使用SHAM和DPI来抑制ROS产生的酶，使用La3+来抑制钙离子的通道。结果发现，只有La3+处理抑制了(GlcN)8诱导的细胞死亡。在rbohD rbohF突变体中，(GlcN)8也会诱导细胞死亡。综上这些结果说明，在拟南芥中，钙离子对于(GlcN)8诱导的细胞死亡是必要的，而不是ROS。
最后，作者提出这样一个model。
model.png
Model 解读
During fungal penetration through stomata,chitin in the cell wall of fungi is digested by chitinases preexisted in the apoplast or secreted by plant cell,leading to the release of CTOS. Guard cells then perceive the CTOS through its receptor,CERK1,which induces SLAC1 activation through a Ca2+ -dependent pathway and consequently stomatal closure to prevent fungal invasion. On the other hand,fungi secrete chitin deacetylases,converting CTOS to CSOS,to evade CTOS-triggered immune response. When CSOS accumulates over a threshold,it is sensed by yet-unknown receptors in the plasma membrane,which triggers cell death also in a Ca2+ -dependent manner to inhibit fungal infection. PM,plasma membrane;CW,cell wall.
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