Science | USB1是一种调节造血发育的miRNA去腺苷化酶
原创 朱颢璐 图灵基因 2023-03-13 10:21 发表于江苏
撰文：朱颢璐
IF= 63.714
推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮点：
1、作者观察到USB1突变人胚胎干细胞（hESCs）损害造血发育。且USB1突变导致3'腺苷酸化增加，但不影响人类干细胞和造血祖细胞中U6 snRNA的水平。
2、作者证实了USB1突变影响血液发育过程中的miRNA水平，而不影响剪接。在USB1突变体的靶向造血发育过程中miRNA水平逐渐改变，USB1去腺苷化miRNA并调节其稳定性。
3、作者通过实验发现PAPD5对miRNA 3'腺苷酸化的调节，挽救了USB1突变体的miRNA水平并恢复了造血输出，挽救miRNA水平恢复USB1突变体的造血发育，从而提出了PN的潜在治疗方法。
核心词汇：
PN:嗜中性粒细胞减少性皮肤异色病，是一种常染色体隐性遗传的骨髓衰竭（BMF）综合征。
miRNA:一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的小分子非编码单链RNA，参与转录后基因表达调控。其具有发夹环结构的前体经加工后与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体（RISC），通过与其靶mRNA分子的3’-UTR互补配对，促使该mRNA分子降解或抑制其翻译，从而调节发育过程。
近日，来自美国华盛顿大学的 Ho-Chang Jeong和科罗拉多大学的Siddharth Shukla等人在国际知名期刊Science上发表了题为“USB1 is a miRNA deadenylase that regulates hematopoietic development“的论文。在这篇文章中，作者证实了USB1作为miRNA去腺苷化酶发挥作用，并提示PAPD5/7抑制是嗜中性粒细胞减少性皮肤异色病（poikiloderma with neutropenia，PN）的潜在治疗方法。
虽然已知USB1调控U6小核RNA的成熟，但PN的分子机制尚不确定，因为mRNA前剪接在患者中不受影响。作者团队生成了含有PN相关突变c.531_delA的人类胚胎干细胞并表明这种突变损害了人类的造血功能,并证明在血液发育过程中，USB1突变体中的miRNA水平失调导致造血衰竭，是因为PAPD5/7未能去除miRNA3′端腺苷酸末端。通过PAPD5/7的遗传或化学抑制调节miRNA 3′端腺苷酸化可挽救USB1突变体的造血。
USB1突变hESCs损害造血发育
作者团队利用CRISPR-Cas9创建了人胚胎干细胞（hESCs），该细胞含有USB1基因中经常发生的c.531_del_A功能缺失突变（以下称为USB1突变体）（图S1、a和B）。作者团队进行了无血清造血分化，以从hESCs获得造血祖细胞（图A）。
在分化结束时（第30天），多能性标记物沉默和造血谱系有效形成（图S2A）。在造血分化的早期阶段，USB1突变细胞没有表现出任何损伤，包括中胚层的形成（第3天；图S2B）和CD34+/CD43−造血内皮细胞（HE）群体（第8天；图S2C）。然而，与野生型（野生型）细胞相比，USB1突变体细胞中CD45+造血祖细胞的形成（第16天）减少（图S2D），造血集落潜力分析显示USB1突变体的集落形成受损（图B）。与USB1在调节造血中的作用一致，与未分化的hESCs相比，成熟血细胞中的USB1 mRNA水平增加了约三倍（图C）。
作者团队专门分析了野生型和USB1突变细胞中中性粒细胞形成的可能性。USB1突变体减少了CD15+/CD66b+谱系的形成，表明中性粒细胞发育异常（图D和图S2E）。使用Dox诱导系统在USB1突变体中野生型 USB1蛋白的条件表达（图S2F）挽救了这些细胞的造血潜能（图E）。
USB1突变导致3'腺苷酸化增加，但不影响人类干细胞和造血祖细胞中U6 snRNA的水平
作者团队初步检查了USB1突变是否影响U6 snRNA，且观察到，与野生型细胞相比，来自USB1突变细胞的U6和U6atac snRNA略长（图F），表明这些snRNA的异常的转录后处理与患者来源细胞中观察到的相似。
作者团队对来自野生型和USB1突变细胞的U6 snRNA的3′端进行测序显示了两个变化。首先，尽管在野生型细胞中，约40%的U6读数终止于Lsm 2-8边界位点附近的+1U，但在USB1突变细胞中，存在额外的Us，大多数末端终止于+3U和+4U（第0天：图G；第16天：图S3A）。U6atac snRNA也观察到类似的结果（图S3B）。第二，作者团队观察到，在USB1突变细胞中，约25%的U6和U6atac 3′端被寡腺嘌呤化（图H和图S3，C和D），而在野生型细胞中，U6的约5%的3′端是寡腺嘌呤化的（图G，插图，图S3，E和F）。
这表明在U6 snRNA成熟过程中，U6 3′端被腺嘌呤化，需要USB1去氨基化和修饰尿苷化的尾部。然而，与野生型细胞相比，USB1突变细胞具有相似水平的这些snRNA，并且没有表现出全局前mRNA剪接变化，这表明USB1改变了其他RNA以影响造血。
USB1突变影响血液发育过程中的mRNA水平，而不影响剪接
作者团队对未分化造血祖细胞（CD34+/CD45+）和成熟血细胞群体中的转录组和野生型的miRNA基因组和USB1突变细胞进行测序（图a），观察到未分化hESCs中USB1突变体的基因表达几乎没有变化（图A）。随着分化的进展，观察到CD34+/CD45+细胞发生了更多的变化，这表明造血缺陷发生在分化的特定阶段（15559个基因中有3310个基因受到FDR<0.1的影响；704个基因下调超过两倍，577个基因上调超过两倍）（图B）。
作者团队丰富了USB1突变细胞中差异表达的基因，以获得参与调节细胞死亡和中性粒细胞分化的基因本体（GO）通路（图S4A）。与USB1缺乏对中性粒细胞分化的影响一致（图。1D），可观察到与野生型细胞相比，在直接中性粒细胞发育时，USB1突变细胞中具有高颗粒侧散的群体减少（图S4B）。最后，还可观察到，与成熟血液群体中的野生型细胞相比，USB1突变细胞中的基因表达发生了更多变化（图S4C）。这表明USB1突变对分化造血祖细胞和成熟血细胞中的基因表达有更大的影响，这与这些特定分化阶段USB1水平的增加相关（图C）。
与野生型细胞相比，没有检测到USB1突变体转录组中的全局剪接变化。在USB1突变细胞中，很少有差异表达的基因被错剪接（图S4，D和E）。先前对PN患者淋巴母细胞的分析也没有发现全局剪接变化（8）。这与USB1突变细胞中U6 snRNA和U6atac snRNA的正常水平一致，并表明USB1缺陷通过不同于mRNA前剪接的机制影响基因表达。作者团队研究了USB1突变体细胞中的特定mRNA变化是否可以解释观察到的造血衰竭，并确定了与有效中性粒细胞形成（即CEBPA和CEBPE）和所有造血（即RUNX1和RUNX2）相关的转录因子在USB1突变体中下调（图C）（16-19）。尽管不影响U6水平和前mRNA剪接，但USB1中的突变损害了关键造血和中性粒细胞发育途径的正确激活，这与这些群体在发育过程中的产量减少一致（图D和E）。
在USB1突变体的靶向造血发育过程中miRNA水平逐渐改变
鉴于miRNA可以调节造血，作者团队还研究了USB1突变是否影响hESC及其造血后代的miRNA水平，且观察到，USB1突变影响了未分化hESC中374个miRNA中82个的水平（P<0.05；49个miRNA下调，33个miRNA上调）（图D），miRNA水平的变化增加在USB1突变体的CD34+/CD45+造血细胞中（771个miRNA中有131个受影响，P<0.05；82个miRNA下调，49个miRNA上调）（图E）。
KEGG分析表明，USB1突变细胞中差异表达的miRNAs主要影响参与癌症进展的途径，包括急性髓系白血病，该病经常与PN相关（图S4F）。作者团队验证了USB1突变体细胞中特异性miRNA的下调，并发现在造血发育的不同阶段，与野生型细胞相比，USB1突变细胞中miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR142-5p、iR-199a-3p和miR-223-3p[主要参与红系、髓系和粒细胞分化]减少（图F）。用Dox诱导系统表达野生型USB1蛋白在造血发育的不同阶段挽救了这些不同miRNA的水平（图F）。与miRNA和mRNA水平的变化相反，在未分化（图S4，G和H）或CD34+/CD45+（图S4I）USB1突变细胞中观察到其他非编码RNA（ncRNA）几乎没有显著变化。
USB1去腺苷化 miRNA并调节其稳定性
假设USB1可能通过去除3′端腺苷酸化的尾部来调节miRNA，否则会触发miRNA降解。为了验证这一假设，我们首先对四种miRNA的3′端进行了测序，这些miRNA在USB1突变细胞中被减少。USB1突变导致未分化hESCs中miR-125a-5p的3′端的腺苷酸阅读水平增加（图A）。在野生型细胞中，miR-125a-5p以1:1的比例终止于基因编码的5′-GUG-3′或5′-GUGA-3′（图a）。然而，在USB1突变细胞中，我们观察到5′-GUG-3′部分的减少和5′-GUGA-3′部分的比例增加（图a）。在CD34+/CD45+造血祖细胞中观察到miR-142-5p、miR-199a-3p和miR-223-3p的类似结果，与野生型相比，USB1突变体含有更多的腺苷酸末端（图B至D）。
对野生型和USB1突变体hESCs（图S5A），或消融USB1的野生型和K562造血细胞（USB1-KO；图S5B）进行miRNA广泛测序分析，证据表明，无论是在hESCs还是在K562中，许多表达水平降低的miRNA在USB1突变体中都显示出3′腺苷酸化的增加。
为了评估USB1是否可以直接去氨基化腺苷酸化miRNA，作者团队纯化了重组人USB1（野生型和一个催化失活突变体H208Q），并测试了其在5′-5（6）-羧基荧光素标记的miR-125a-5p底物上的活性（图G）。我们观察到，野生型（但不是催化失活的USB1）以时间依赖的方式有效地从miR-125a-5p的3′端去除腺苷，如在天然miR125a-5p（其3′端具有单个a）、oA和oUA底物中观察到的缩短产物所示（图G至I）。USB1还能够快速去除U6 snRNA寡核苷酸3′端的腺苷（图J至L）。这表明USB1在体外可以作为miRNA和U6 snRNA的去腺苷化酶。数据表明，USB1也可以从RNA底物中去除单个尿苷残基，但不能有效去除聚（U）尾。
具体而言，USB1缓慢地从寡尿苷基化miR-125a-5p底物的3′端去除一个尿苷，如通过出现短一个核苷酸的少量产物所观察到的（图G至I），作者团队用更短的RNA底物证实了这一点（图S6，D和E）USB1还从U6 snRNA的寡尿苷化3′端去除了单个尿苷残基（图J和K）。
PAPD5对miRNA 3'腺苷酸化的调节挽救了USB1突变体的miRNA水平并恢复了造血输出
作者团队的数据表明，血液发育所需的不同miRNA的表达缺失导致了PN患者中观察到的造血缺陷，这是由于USB1未能去除3′端腺苷酸末端。因此，用RG7834抑制PAPD5/7非经典聚（A）聚合酶挽救了在USB1突变细胞中减少的miRNA水平（图A和B）。
此外，用RG7834处理USB1突变体导致了腺嘌呤化miR125a-5p的减少，这被非腺苷化形式的增加所补偿，这表明这些酶负责在USB1突变体中增加的miRNA的3′端添加腺嘌呤化尾部（图C）。通过使用短发夹RNA的组成性沉默抑制PAPD5（图S7A）也挽救了受USB1突变影响的miRNA水平接近野生型的水平（图D）。在PAPD5/7的化学抑制或基因沉默后，没有观察到乘客miRNA链水平的任何变化（图S7，B和C）。
这些结果表明，PAPD5/7活性的抑制应通过阻止miRNA的3′端腺苷酸化来挽救在USB1突变细胞中发现的造血发育缺陷。
挽救miRNA水平恢复USB1突变体的造血发育
作者团队设计了具有miR-125a-5p、miR142-5p、miR-199a-3p和miR-223-3p组成性表达的USB1_c.531delA突变体hESCs（图S7H）。这实现了对USB1突变体中红系和髓系造血输出的挽救，达到与野生型细胞相似的水平（图G）。
这表明，在USB1突变体中，miRNA缺乏与造血衰竭有关。此外，用靶向miR-125a-5p、miR-142-5p、miR-199a-3p和miR-223-3p的miRNA抑制剂治疗野生型CD34+造血细胞（图S7I）导致其集落形成能力显著下降（图H）。这些结果表明，血细胞USB1突变的造血发育损害与这些miRNA的受损水平直接相关。
总而言之，作者团队已经证实USB1的功能是使miRNA去腺苷化，限制其降解并增加其丰度，而USB1的这种去腺苷化活性调节造血。这表明USB1是第二种去尾酶，类似于PARN（23），它可以从ncRNAs中去除寡（A）尾，以增强其稳定性。抑制负责miRNA腺苷酸化的酶PAPD5和PAPD7，挽救了在USB1突变细胞中观察到的造血缺陷。作者团队的结果提供了对USB1突变患者发病机制的分子理解，并提示PAPD5/7抑制剂可能是PN患者的治疗选择。
教授介绍
Ho-Chang Jeong博士后，在庆熙大学韩医生命工学专业获得学士学位。2017年，他在西江大学生命科学系(师从车赫镇博士)获得了博士学位。Ho-Chang于2018年加入巴蒂斯塔实验室，他对破译端粒酶和端粒在造血和肝脏发育中的作用很感兴趣。在实验室外，Ho-Chang喜欢骑自行车，喝着啤酒看电影。
Siddharth Shukla，科罗拉多大学博尔德分校罗伊·帕克博士实验室的博士后研究员。博士研究集中于揭示RNA质量控制途径在人类疾病亚类“RNP低组装疾病”中的作用，且已经证明了特定的RNA衰减途径导致了SMA（脊髓性肌萎缩症）中snRNAs水平的降低和人类端粒酶RNA水平的降低。目前的研究重点是发现其他人类非编码RNAs的RNA质量控制途径，其缺失会导致多种人类疾病。
参考文献
Jeong HC, Shukla S, Fok WC, Huynh TN, Batista LFZ, Parker R. USB1 is a miRNA deadenylase that regulates hematopoietic development. Science. 2023 Mar 3;379(6635):901-907. doi: 10.1126/science.abj8379. Epub 2023 Mar 2. PMID: 36862787.
2022年热文TOP10
2、Science | 靶向蛋白降解途径突破，几乎可用于任何疾病相关蛋白
3、Cell Metab 丨 靶向肿瘤微环境中CD8+T细胞代谢的治疗潜力
4、Nature Cancer | 肿瘤相关成纤维细胞的单细胞分析
6、Nature | 线粒体膜形态如何影响CD4+ T细胞分化
10、Cancer Cell | 肿瘤免疫新进展：全基因组筛选发现T细胞耗竭调节因子
图灵基因面向科研工作者推出的 TB-1 数字病理切片扫描仪，自带AI建模和模型解释功能，有望帮助您发现更多细胞和组织空间结构规律。
简单易用，轻松构建原创模型，成本可控，门槛低
联系微信号：aipathology 电话：18121496883 （刘女士）
网友评论