Integrated multi-omics characterization of KRAS mutant colorectal cancer
KRAS突变型结直肠癌的综合多组学特征分析
发表期刊：Theranostics
发表日期：2022 Jul 4
DOI: 10.7150/thno.73089
一、背景
结直肠癌（CRC）在新病例中排名第三，是全世界癌症相关死亡的第二大原因。人们普遍认为CRC是一种异质性疾病，其发病机制涉及多种基因改变和多种途径。KRAS是CRC中最频繁突变的致癌基因之一。
最近，能够特异性地与KRAS-G12C突变体中的半胱氨酸残基结合的等位基因特异性共价抑制剂在临床上显示出良好的效果。然而，临床研究意外地报道，这些药物在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的反应率很高，但在结直肠癌患者中却很有限，表明KRAS突变型癌症的肿瘤间异质性。
二、材料与方法
1.数据来源
1）通过临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）结肠癌数据库获取检测到KRAS突变的结直肠癌样本的多组学测序数据和临床注释；从cBioPortal获取TCGA-COAD/READ队列和CCRC队列。
2）采用靶向MSK-IMPACT面板测序的KRAS突变测序（MSK队列）和TaqMan探针测序的等位基因判别（CIT[GSE39582]和GSE87211队列）来验证临床结果和分子分型结果，共有2579个具有可用的omics和临床数据的CRC样本被纳入本分析中
3） 蛋白质组和磷酸蛋白组数据主要来自CPTAC和CCRC队列
4） 单细胞RNA-seq：GSE132465和GSE144735
5） 人类结直肠癌细胞系（N=112）的临床注释和表达谱从CCLE获得
2.实验流程
1） 基因组改变的比较：从CPTAC队列和TCGA-COAD/READ队列中下载并整理了体细胞突变和拷贝数改变（SCNA）段数据，用于基因组分析；KRAS的非同义突变（包括框架转换突变、框架内突变、错义突变、无义突变和剪接位点突变）的肿瘤被视为KRAS突变的肿瘤；采用 "maftools "包从体细胞突变数据中提取突变特征；GISTIC2被用来检索基因水平的拷贝数值
2） KRAS突变肿瘤样本的共识分子聚类：采用三种类型的omics数据--RNA转录组数据、推算的蛋白质组数据和推算的磷酸蛋白组数据，利用R软件包 "CancerSubtypes "的默认参数形成相似性矩阵；相似性矩阵被用作使用R软件包 "ConsensusClusterPlus "进行无监督聚类的输入；变量选择分析用于KRAS突变体子集的基因特征选择，用随机森林算法进行
3） CRC TME中浸润细胞的推断：xCell
4） 对CRC中的细胞景观进行单细胞分析
5） 结直肠癌细胞系和药物敏感性分析：三个药物敏感性数据库（CTRPv2.0、PRISM和GDSC1）是通过癌症依赖性地图（DepMap）门户网站获得
6） 统计学分析：t检验、Wilcoxon检验、Kruskal-Wallis检验和单程方差分析；生存分析、Cox比例风险模型
三、实验结果
01 - KRAS突变型与KRAS野生型结直肠癌的分子比较
作者总结了KRAS激活信号通路和各节点的相关抑制剂（图1A）。框中所列的各种KRAS抑制剂是针对KRAS信号通路的每个节点而开发的，然后在临床前或临床研究中进行评估（图1A）。棒棒糖图显示，在TCGA和CPTAC数据集中，最常见的KRAS突变是KRAS-G12D/V/S/C，其次是G13D/C（图S1A-S1B）。进行了生存分析以研究KRAS突变在CRC患者中的预后价值，K-M分析表明通过全外显子组测序确定的KRAS突变组的结果更差（图1B），在调整了年龄、性别、临床分期和MSI状态后，该关联在多变量回归模型中仍有意义（图1C），还在独立的靶向小组测序队列中验证了这些结果（图S1C）。
为了获得对KRAS-突变型（Mut）和KRAS-野生型（WT）组不同临床结果的机理认识，作者根据转录组表达谱进行了基因集富集分析（GSEA）。KRAS-Mut组在致癌信号通路中表现出较高的富集度，如肿瘤中的上皮-间质转化和Wnt信号（图1D）。然而，KRAS-WT组主要在趋化因子受体结合趋化因子、淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用、PD-1信号传导等基因组中表现出富集，表明免疫激活更强（图1D）。还利用蛋白质组学数据来确定不同调节的蛋白质和过度代表的途径。肿瘤恶性表型相关的IGFBP2和KRT18在KRAS-Mut亚型中明显富集，而中性粒细胞和巨噬细胞相关的CD177、MMP1和ARG1则在WT亚型中富集（图S1D-S1E）。接下来，策划了来自CPTAC队列的转录组、蛋白质组和磷酸蛋白组数据，并比较了KRAS-Mut与KRAS-WT肿瘤的全球差异性调节。KRAS-Mut肿瘤显示出肿瘤迁移（TGFBR2-S553和EPHB3）和PI3K/AKT激活（PIP4K2C和PIK3R1）的明显上调，而KRAS-WT组在免疫调节（TAP1/2、IFITM1和IFIH1-S301）和细胞代谢（DGAT1和HINT3）方面富集（图1E）。
作者首先比较了KRAS-Mut与KRAS-WT的肿瘤突变负荷，观察到TCGA和CPTAC队列中没有差异（图S1F-S1G）。在大多数类型的肿瘤中，接受免疫检查点抑制剂的免疫反应率在KRAS-Mut和-WT组之间没有明显的差异（图S1H）。进一步比较了KRAS-Mut和KRAS-WT样本的体细胞拷贝数改变（SCNAs）和非整倍体分数。在染色体水平上，KRAS-Mut肿瘤显示出比WT肿瘤更低的臂级SCNAs程度，改变主要集中在chr5q、chr9q和chr12上（图1F）。此外，观察到KRAS-Mut与WT肿瘤相比，非整倍体分数（肿瘤中臂级增益和损失的总数）明显较低（图1G）。利用体细胞相互作用功能，检测KRAS突变与CRC中25个最常见的突变基因之间的关系（图1H）。ARID1A和ACVR2A突变与肿瘤中的KRAS突变相互排斥，进一步表明了CRC中的基因畸变。
图1 KRAS-Mut与野生型结直肠癌的分子比较
图S1 CRC中KRAS突变的分子特征
02 - 分析KRAS-Mut结直肠癌的单细胞转录组景观
作者利用基于大量RNA-seq数据的xCell算法来量化基质和免疫细胞的浸润，并研究了CRC中细胞亚群的变化。大多数细胞亚群在KRAS-Mut和KRAS-WT肿瘤之间有明显不同。KRAS突变的肿瘤的特点是上皮细胞和Treg细胞的增加，而KRAS-WT肿瘤的特点是CD4+T细胞、巨噬细胞、pDCs等（图2A）。
为了更准确地描绘KRAS-Mut CRC的细胞亚群景观，从SMC和KUL数据集中收集和策划了10倍的单细胞RNA-seq转录组数据，并通过相互PCA工作流程将它们整合到一个合并的scRNA-seq数据集中（图S2A）。最后获得了来自16个KRAS-WT和13个KRAS-Mut结直肠肿瘤的共55539个单细胞，并通过Seurat进行分析（图2B）。采用了基于图形的聚类方法，将CRC细胞分成29个具有不同表达特征的聚类（图S2A-S2B）。确定了六种主要的细胞类型，即淋巴细胞/浆细胞、上皮细胞、成纤维细胞/内皮细胞、骨髓细胞、T/自然杀伤（NK）/NK T淋巴细胞和肥大细胞（图2B），发现T细胞、B细胞、髓细胞和基质细胞在KRAS-Mut与KRAS-WT肿瘤中的分布明显不同（图2B）。因此，提取了四个主要的细胞类型，并进一步将其细分为特定的细胞亚群。采用了上述相同的工作流程，将T细胞、B细胞、髓系细胞和基质细胞分别分为八个、五个、八个和十一个亚群（图2C）。比较分析显示，CD4+T细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞的细胞亚群分布在KRAS-WT肿瘤中明显升高，而IgG+浆细胞（B细胞）、SPP1+巨噬细胞（髓系细胞）和肌成纤维细胞（基质细胞）在KRAS-Mut肿瘤中明显增加（图2C-2D）。图S2C中显示了这些关键细胞亚群在UMAP图上的代表性标志物。
图2 剖析KRAS-Mut结直肠癌的单细胞转录组景观
图S2 KRAS-Mut结直肠癌的单细胞转录组图谱和每个集群的代表性标志物
03 - 识别KRAS-Mut亚群的分子亚型
作者进一步整合了CPTAC数据集中公开的转录组、蛋白质组和磷酸蛋白组数据，研究了KRAS-Mut肿瘤的共识分子亚型和治疗漏洞（图3A）。用相似性网络融合（SNF）的方法进行了基于三种全向性数据的无监督聚类，并将KRAS-突变的CRC分为两个稳健的子集（指定为KM1和KM2；图3B）。无监督聚类也被应用于每一层独立的全息数据，结果显示单独来自转录组、蛋白质组或磷酸蛋白组的子集的平均剪影宽度小于来自综合多组学的子集（图3C），表明三类全息数据的整合可以更准确地分类KRAS-Mut结直肠癌。使用随机森林学习模型提取了区分亚型的最重要的分子特征，确定了5个mRNAs、10个蛋白质和19个磷酸蛋白分别为mRNA、蛋白质和磷酸蛋白水平的亚型特征（图3D）。作者利用TCGA、CIT和GSE87211队列中识别的mRNA特征和CCRC队列中的蛋白质特征，对KRAS-Mut肿瘤进行无监督聚类，独立队列中的签名表达与CPTAC队列中的签名基本相似。进一步比较了CPTAC和TCGA中KM1和KM2亚组之间KRAS的突变残基（G12D/V/C，G13D等），发现两个亚型之间没有统计学意义上的差异（图3E-3F）。
为了探索亚型特征的潜在临床效用，比较了两个分子亚群之间的预后。CPTAC队列中的KM1亚型与更好的预后有关，相比于KM2亚型没有死亡结果，尽管考虑到样本量小，生存分析没有统计学意义。还比较了独立队列中基于KRAS分子亚型的预后，确定在TCGA、CIT、GSE87211和CCRC队列中，KM1亚型与较好的生存期显著相关（图3H，图S4A-S4C）。多变量Cox比例风险回归分析进一步表明，在这些KRAS-Mut样本中，调整了临床病理因素后，KRAS突变亚型与患者的生存结果相关（图S4D-S4G）。
图3 通过KRAS-Mut的分子亚型识别结直肠癌患者的基因组和预后特征
图S4 在独立的KRAS-Mut CRC队列中验证KRAS分子亚型的预后意义
04 - KRAS突变的结直肠癌的肿瘤基因组变异
作者在CPTAC和TCGA队列中进行了SMG分析，并比较了KM1、KM2和KRAS-WT子集中的基因突变频率。TCGA和CPTAC队列的突变情况显示，ARID1A和BRAF在KRAS-WT亚组的突变率高于KRAS-Mut亚组（图4A）。在更大样本量的TCGA队列中，也显示在KRAS-Mut样本中APC和PCBP1的突变频率高于WT肿瘤样本（图S5A）。然后，作者分析了CRC肿瘤中KM1、KM2和KRAS-WT亚型中96个可能的突变的矩阵中的单核苷酸变异（SNVs）（图4B）。饼状图显示，与KRAS-WT肿瘤相比，KM1和KM2肿瘤的C>A转换略有增加（图4B）。Lego图显示，CRC中最主要的突变是ApCpN三核苷酸位点的C>T转换，而GpCpG位点的C>A转换在KM2亚型中特别突出（图4B），表明KRAS突变异质性中的特定突变过程正在运作。
随后，从基因组数据中提取了五个突变特征（图S5B），包括DNA错配修复相关特征的缺陷（SBS15和SBS44），5-甲基胞嘧啶的自发或酶促脱氨（SBS1），以及聚合酶ε外切酶域突变（SBS10b）（图4C）。归于SBS44特征的突变数在KRAS-WT肿瘤中显示出明显的增加，而SBS15特征在KM1亚型中显示出明显的减少（图4D）。还分析了KM1和KM2亚组的SCNA水平，发现在KM1肿瘤中明显升高（图S5C）。臂水平SCNA结果表明，在chr2、chr5p、chr7q、chr8p、chr12和chr16的细胞带包含最频繁的扩增或删除区域（图S5D）。病灶水平的SCNAs显示，KM1亚型的2q31.2、5p15.33、7q36.3和KM2亚型的12p13.33的细胞带含有明显放大的病灶区；而KM1亚型的16p13.3和KM2亚型的1p35.3-36.32、8p11.22、18q11.2的细胞带含有频繁删除的区域（图4E）。CNA的基因组改变促成了KRAS-突变亚型的分子异质性。在TCGA KRAS突变亚型中也发现了SCNA细胞带的类似基因变异（图S5E）。
图4 KRAS-Mut结直肠癌的肿瘤基因组图谱
图S5 KRAS-Mut结直肠癌的肿瘤基因组改变
05 - KRAS突变模式以特定的临床特征和分子过程为特征
在CRC肿瘤中进一步探讨了KRAS突变模式与临床特征和分子亚型的关系。KRAS突变亚型的前50个差异表达的mRNA转录物、蛋白质和磷酸蛋白显示在热图中（图5A）。有趣的是，所有MSI阳性的肿瘤都聚集在KRAS-WT亚组，并导致高突变表型、MSI和免疫相关的CMS1转录组亚型、BRAF和ARID1A突变的聚集。KM2与肿瘤晚期、间质表型、CMS4转录组亚型、ProS-C蛋白组亚型和免疫亚型2（图5A,5B）有关，这表明基质侵袭、血管生成和预后较差。KM1亚型的主要特征是肿瘤早期，CIN表型，上皮和代谢相关的CMS3转录组亚型，ProS-E蛋白组亚型和免疫亚型1，这表明上皮特征和更好的生存结果。在TCGA队列中也确定了类似的结果（图5C）。
作者进一步分析了肿瘤的生物学特征，以探索KRAS-Mut亚群内有代表性的免疫和癌症相关过程。在CPTAC队列的前六个差异分子特征中，KM2亚组表现出巨噬细胞、MDSCs、缺氧特征、EMT特征、Pan-F-TBRs和基质得分的最高富集，其次是KM1亚组和KRAS-WT亚组（图5D）。ImmuneScore和T细胞耗竭水平在KRAS亚群中也有不同的分布，而在突变负荷方面没有统计学意义。还在TCGA队列中进行了相同的分析，得到了类似的结果。进一步采用xCell算法来数字化描绘和剖析三个KRAS亚群组织中的细胞异质性景观。KM2的特点是活化树突状细胞（aDCs）、脂肪细胞、星形细胞、M2巨噬细胞、间充质干细胞（MSCs）等的增加，而KM1亚组则以记忆B细胞和NK细胞区分（图5E）。
图5 以特定临床特征和分子过程为特征的KRAS-Mut模式
06 - 通过蛋白质组学和磷酸蛋白组学分析对KRAS突变模式进行功能注释
作者在RNA、蛋白质和磷酸蛋白水平上对KM1和KM2肿瘤亚群进行ssGSEA/转录后修饰（PTM）和Metascape分析。RNA和蛋白水平的通路富集表明，KM1主要富集在过氧化物酶体、MYC靶点和Wnt β-catenin通路，而KM2主要富集在EMT、凝血、血管生成、KRAS信号增强和肌体生成过程（图6A）。磷酸蛋白数据集的PTM分析显示，KM2的特点是PKACA、VEGF、PI3K和JAK的激酶活性上调，而KM1肿瘤的特点是MEK、PI3K/mTOR和Taxol的药物目标。收集了CCRC队列中KRAS-Mut肿瘤的蛋白质组学数据，并进行了ssGSEA，结果与CPTAC队列中的数据相似（图S7A）。此外，EMT过程和血管生成途径的代表蛋白在KM2亚型中明显高表达，然而RBM15和HNRNPM和RFC4和CDK11B在KM1亚型中明显过度表达（图6B）。
还确定了KM1和KM2肿瘤之间的差异表达的蛋白质，并用Metascape工具进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。得到的网络包含了参与物理相互作用的蛋白质子集。根据MCODE算法，确定了18个蛋白质子群，如图S7B所示；每个群中的蛋白质共享相同的GO术语和KEGG途径。然后，比较了CPTAC队列中KM1和KM2亚群的磷酸化位点的表达，发现粘附信号相关的磷酸化位点FLNA-S1630和MYO1F-S1023以及间质表型相关的位点VIM-S5、COL1A1-S176和TFB1I1-S143的磷酸化在KM2亚组明显上调。此外，酪氨酸蛋白激酶受体EPHB2-S776和细胞周期相关蛋白CDK11A-S577和CDK13-S432的水平在KM1亚组中明显升高（图6C）。然后，根据不同的磷酸化位点进行了途径和过程的富集分析，发现许多途径和功能被明显富集，这些功能和途径大多是由KRAS亚型介导的（图6D）。检索了CCRC队列中的蛋白质组和磷酸蛋白组数据，并进行了Metascape分析，结果与CPTAC队列中的数据相似（图S7C-S7F）。在CPTAC和CCRC队列中进一步的激酶底物富集分析（KSEA）显示，CDC样激酶CLK1/2、细胞周期蛋白依赖激酶CDK1/7和细胞外信号调节激酶（ERKs）MAPK1/3在KM1亚组中明显富集。然而，细胞凋亡相关的激酶PAK2和PAK5以及AKT丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶在KM2亚组中明显富集（图6E，图S7G）。
图6 通过磷酸蛋白组分析对KRAS-Mut亚型进行功能注释
图S7 CCRC队列中KRAS-Mut亚群的蛋白质组学和磷酸蛋白组学特征分析
07 - 分子特征和药物敏感性之间的相关性分析揭示了KRAS-Mut结直肠癌的亚群特异性治疗方法
为了探索KRAS-Mut亚型在CRC中的潜在脆弱性，作者比较了DepMap数据集中的结直肠癌细胞系中基于大规模RNAi筛选的基因依赖性。策划了41个KRAS突变的CRC细胞系，并将其分为KM1或KM2子集，确定了31个基因在KM1和KM2子集之间有明显不同的依赖性得分（图7A）。以平均依赖性分数小于-0.3为分界点，确定了13个基因为亚群特异性癌症依赖性基因（图7B）。其中，KM2亚型包括PI3K/AKT信号相关的ZFP36L1和VEGF信号相关的COL5A1和TLN1；KM1亚型包括细胞周期/有丝分裂依赖的CCNB3、RAD21和核心Wnt信号分子CTNNB1。
为了进一步确定KRAS突变型CRC亚型的亚群特异性治疗药物，应用三个药物反应数据库（CTRP-v2、PRISM和GDSC1）来研究KM1和KM2细胞亚群的潜在治疗药物（图7C）。在KM1和KM2亚群之间进行差异性药物反应分析，以确定每组中估计AUC值较低的特定化合物。这些分析产生了8个CTRP衍生的化合物和10个PRISM衍生的化合物以及11个GDSC衍生的化合物（图7C）。在三个药物库的共同药物靶点中，在CTRP和GDC数据库中都发现了KM2亚型的PI3K抑制剂。
随后进行了多角度分析，研究这些化合物在CRC中的治疗潜力。首先使用连接图（CMap）数据集来识别那些基因表达模式与KRAS亚型特异性表达模式相反的化合物。用于KM2亚型的六个化合物和用于KM1亚型的三个化合物的CMap得分低于-90（图7D）。进一步比较了候选药物靶点的蛋白质表达模式，并检索了实验和临床证据来筛选潜在的药物。总的来说，PI3K/AKTi、MEKi和FGFRi具有强大的体外证据，被认为对KM2 CRC患者具有最有希望的治疗潜力。此外，floxuridine和CDKi也有可能在第一类CRC患者中发挥治疗作用。还探讨了每个KRAS亚型中与MEKi、ERKi或AKTi的敏感性高度相关的潜在基因调节器，这可能是对此类抑制剂反应的潜在指标。最后，生成了一个总结KRAS-Mut亚型的信号通路的示意图，以概述在KRAS突变型CRC中的发现（图7E）。
图7 分子特征和药物敏感性之间的相关性揭示了KRAS-Mut结直肠癌的亚组特异性药物
四、结论
总之，综合蛋白质基因组学特征揭示了新的分子亚型和针对KRAS突变的结直肠癌的信号蛋白、磷酸位点和基因组改变的治疗机会。虽然这些治疗假设的验证超出了目前的研究范围，但对分子表型和突变谱的表征可能使揭示KRAS-突变肿瘤的分子异质性取得实质性进展。
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