单细胞测序方法和原理系列：
- 1. 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics
- 2. DNA文库构建和Illumina测序化学原理
- 3. 单细胞免疫组库：TCR基因重排原理和TCR测序建库方法
- 4. 单细胞ATAC-seq原理介绍与报告解读
- 5. CITE-seq：同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序
- 6. LIBRA-seq：快速开发单克隆抗体的单细胞技术
- 7. 液滴型单细胞测序技术的比较
- 8. CEL-Seq原理
- 9. 单细胞3'文库和5'文库的区别
1. 简介
CRISPR筛选是一种强大的方法，可以研究某些基因的定量表达如何影响复杂的细胞表型和进程。10x Genomics的Chromium单细胞CRISPR筛选解决方案，使研究人员能够以单细胞分辨率分析数百个不同的CRISPR扰动，并检测与基因表达表型直接关联的单链向导RNA(sgRNA)。与批量CRISPR筛选或逐一敲除相比，这种全面的方法让研究人员能够实现更高的通量、更高的实验效率和分辨率，从而探索遗传扰动的整体转录组影响。
2. 原理
2.1：3'文库原理
在设计sgRNA的时候，在sgRNA上面设计添加capture sequence序列，这个序列能和10x Gel Beads上原有的capture seq序列互补。
这样通过这种sgRNA转化后的细胞直接通过10x平台对单细胞进行捕获，在小油滴的反应体系中Gel Beads上的oligo序列在捕获mRNA的同时也会捕获细胞中的sgRNA序列，并且根据sgRNA上的protospacer序列知道是哪一种sgRNA转导进了细胞，这样就能在检测细胞转录组数据的同时检测这个细胞受到哪种sgRNA的编辑以及编辑后基因表达的情况。
可以看到这个gel beads上面的barcode比普通单细胞要多两种，尾端分别是Capture Seq 1和Capture Seq 2
CROP-seq
文库：
参考：
Guide RNA Specifications Compatible with Feature Barcoding technology for CRISPR Screening
Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ Reagent Kits v3.1 (with Feature Barcoding technology for CRISPR Screening)
2.2：5'原理
在3' crispr筛选方案中，我们需要重新设计合成sgRNA。引入能被胶珠所捕获的capture sequence（还需要经过一定的筛选和优化选择的过程）。5' crispr筛选方案则大大简化了这一过程。它可以直接使用市面上常用的sgRNA原始文库（可以对比下面的左图和上面3'的sgRNA），也可以兼容设计好的3' sgRNA文库。
参考：
Chromium Next GEM Single Cell 5' Reagent Kits v2 (Dual Index) with Feature Barcode technology for CRISPR Screening
Chromium Single Cell CRISPR Screening – Experimental Planning Guide
3. 其他注意点
- 所要筛选的sgRNA文库大小和细胞数
> 每种sgRNA推荐覆盖100-200个细胞（只有覆盖了足够多的细胞数，cellranger分析时才能设置合适的UMI阈值来进行sgRNA的分配以及差异基因表达分析）
> 每个基因推荐设置1-5个sgRNA
> 非靶标sgRNA需要至少占到整个sgRNA文库的10%以上（cellranger分析时必须包含非靶标sgRNA才能进行合适的差异表达分析）。
例如：有20个目的基因，每个基因设置2条sgRNA（共40条），可以设置5条非靶标sgRNA（共45条）。因此至少需要获得4500个细胞。
- 还需要考虑所采用的细胞类型
比如说研究的目的基因表达量较低而所采用的细胞RNA含量较高（如肿瘤），为了观测到目的基因的变化，我们就需要加大测序深度，测序成本就会提升。这时就可以选择RNA含量不是那么高的细胞进行实验。
4. 成功与10x结合的Cas9方法
5. 已有方法
单细胞CRISPR筛选方法包括Perturb-seq (GBC Perturb-seq)、CRISPR-seq、CROP-seq等。类似于混合筛查，这些新方法使用CRISPR-Cas9系统在单个样本中并行生成多达数千个遗传扰动，但使用单细胞RNA-seq（single cell RNA-seq, scRNA-seq）作为读数。该方法可以同时测量每个细胞的扰动和表型。这些新技术不依赖于特定表型或存活，表型被记录为整个转录组，为解析基因功能关系提供了大量数据。基于plate的scRNA-seq平台还可以为每个细胞进行附加测量，如成像或FACS数据。所有这些新方法都成功地将丰富的表型信息与细胞平板中的每个特定扰动相关联，有助于实现大规模基因组功能筛查。
Genetic screening enters the single-cell era. Nat Methods. 2017 Feb 28;14(3):237-238.
16年Cell：Perturb-seq
16年Cell：CRISPR-seq
17年Nature Methods：CROP-seq
将CRISPR筛选融入scRNA-seq，在技术上并不容易。CRISPR驱动的扰动需要从RNA聚合酶III（Pol III）特异性U6启动子处，表达高水平的靶向特定基因的单向导RNA（single guide RNA, sgRNA）。但是sgRNA缺少poly（A）尾端，所以其身份不能通过标准scRNA-seq方法读出。所有这三种方法通过产生携带pol III:sgRNA和Pol II驱动的可选择和/或荧光标记的载体来解决这个读出问题，其中3'UTR含有sgRNA特异性序列。PERTURB-seq和CRISP-seq依赖于芯片克隆策略产生的RNA库，来将每个sgRNA链接到特定的扰动条形码转录物上。相比之下，CROP-seq的克隆解决方案更为简单优雅：将Pol III:sgRNA复合体整合到报告转录物中，并插入到慢病毒载体的长重复序列末端中。这样Pol III:sgRNA复合体在病毒整合期间会被复制。这种简化的克隆方法使得CROP-seq与现有的CRISPR筛查sgRNA库融合在一起。
限制：这些方法需要载体来表达多聚腺苷化的索引转录本以及非聚腺苷化的向导RNA。这就限制了单细胞CRISPR筛选的 规模，让组合式扰动难以实现，或根本无法实现。
参考：
新产品发布网络研讨会：更快速地获得单细胞CRISPR结果
10x Single Cell CRISPR Screening Videos
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