Biomamba荐语

这是一篇粉丝来稿，该文献是2021发表在《Nature communication》的《Single cell T cell landscape and T cell receptor repertoire profifiling of AML in context of PD-1 blockade therapy》，文章介绍了在经过PD-1免疫治疗前后AML（急性髓细胞性白血病）病人T亚群和占比的变化，提出可以使用免疫治疗前T细胞克隆型和GZMK CD8+T细胞所占比例来预测免疫治疗的效果。与《NC》一贯的风格一样，该文包含了众多的Figure，但是这篇文章中的图片我个人觉得比较美观，达到了信达雅的标准。并且这是一篇使用monocle3来进行拟时序分析的文章，感兴趣的同学不要错过。

doi:
https://doi.org/10.1038/s41467-021-26282-z

链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-26282-z

样本来源

● ① 2个健康样本，8个病人，其中病人的不同治疗阶段取样，得到8份治疗前样本和14份治疗后样本，最终得到了13633个细胞的正常样本细胞和60753个细胞的AML病人样本

● ② 经过免疫检验点治疗后有3位病人有治疗效果，3位病人病情持续恶化，2位病人病情稳定

● 文章通过分析样本scRNA和T cell receptor (TCR)去预测肿瘤异质性，由于T细胞免疫应答是免疫治疗的重要指标，因此此处探究了TCR图谱对于免疫治疗的影响

Results

● 1 Cluster definitions in healthy and AML BMs(bone marrow)
● 该部分主要介绍了正常样本和病人样本的分群结果。

● ① 健康人细胞分群

根据已知的bone marrow的细胞marker对样本细胞进行细胞注释。

●分群结果

● 将正常人样本与肿瘤病人样本混合后继续分群，验证分群效果是否可靠，可以看出正常样本与肿瘤样本细胞分群结果差异明显。

● 对来自不同病人的样本混合，以病人和治疗前后为分群条件，显示不同时间的细胞组分差异。

● 通过对不同病人样本单独分析，发现存在肿瘤异质性，可以看到不同病人样本细胞组分差异较大。

● 2 Variable capacity for TCR clonotype expansions following treatment

● 该部分主要介绍了在免疫治疗前后部分病人T细胞克隆性（个人理解是T细胞表面配受体种类）增加，同时T细胞克隆性增加与治疗效果正相关。
与正常样本比较，AML病人样本中T细胞表面克隆性无论是种类还是数量都增加。

● 同时发现3个有治疗效果（原文说对免疫治疗responders，此处理解为有治疗效果）的病人和2位SD（stable disease）病人他们治疗前数量最多的T细胞随着治疗数量增加，NR（non-responders）治疗前数量最多的T细胞随着治疗数量减少。

● 这说明在治疗前后T细胞是可变的，不同的T细胞受体克隆型病人对于免疫反应治疗的反应是可变的，这与在原先研究中观察到的肿瘤异质性的结果是相一致的。

● 将所有克隆性比较分析，在治疗后数量增加的克隆型77%来源于responders，18%来源于SD，数量减少的克隆型70%来源于NR和SD病人，所以T细胞表面受体克隆型的变化与治疗效果密切相关。

● 3 Heterogeneity in T cell populations of AML patients

● 对T细胞进一步分亚群，统计不同样本中细胞比例，发现不同病人T细胞组成成分的异质性。

● 可以发现不同细胞比例在治疗前后发生变化（比例分别为治疗前和治疗后细胞类群比例）

CD4+ 53% 30.9%

CD8+ 35% 37.4%

CD4:CD8 ratio 1.51% 0.82%

gamma-delta (γδ) 2.3% 8.5%

invariant T (MAIT) 2.1% 14.4%

(unconv T) 7% 8.5%

● 主要变化是在治疗前后经典的T细胞类群如CD4+和CD8+T细胞含量下降，非经典的T细胞类群如gamma-delta、MAIT等细胞类群上升，同时通过上图可以看出几乎所有的MAIT细胞来自于PT1，说明即使在AML病人中依旧含有肿瘤异质性，这些发现揭示了不同患者和反应组之间的异质性T细胞表型，并揭示了治疗后发生的动态变化。

● 4 Subclassification of T cells reveals distinct cellular phenotypes

● 该部分主要探究了T细胞表型在responders和non-responders样本的差异性。

● 首先根据marker对T细胞（CD4和CD8）分别进行分群，将CD4+ T细胞进一步分为CD4+ naïve、CD4+ FOXP3+ (Treg), T helper 1 cells (TH1)、TH17 cells, and CD4+ cytotoxic (CTL) cells，将CD8+ T细胞进一步分为CD8+ naïve, CD8+ STAT1 (enriched for STAT1 and expressed IFNγ pathway genes), CD8+ GZMK (enriched for GZMK expression), and CD8+ CTL (enriched for cytotoxic markers GZMB, GNLY and PRF1)。

● 同时标记了细胞毒性和细胞耗竭程度，在治疗前，细胞毒性和耗竭分数都要小于治疗后，同时治疗前后CD8+T细胞由naïve细胞向GZMK和CTL状态转变。

● 实验者发现在responders中CD8+ GZMK在免疫治疗前数量多与NR，但CD8+ CTL数量少于NR，在治疗前，responders的耗竭得分与SD和NR具有显著差异，同时治疗后responders的耗竭系数增加然而NR耗竭系数减少，说明CD8+ GZMK和CD8+ CTL细胞比例对于预测病人治疗情况具有明显帮助。

● 根据GZMK含量进行生存分析，发现高表达GZMK含量的病人具有更高的存活率，这表明了有高活性GZMK的免疫系统可以显著改善AML病人的预后能力。

● 5 Pseudotemporal trajectory analysis revealed a CD8+ continuum

● 实验者随后针对CD8+T细胞展开拟时序分析，发现随着拟时间推进，GZMB和GNLY含量升高，同时GZMK表达量降低，这与细胞类型的演化相一致，随着时间的进行，T细胞从GZMK-expressing CD8+逐步走向 CD8+ CTL。

● 实验发现GNLY在CD8+ CTL细胞中表达但是不在CD8+ GZMK细胞中表达，同时GZMK与GZMB,GNLY,PRF1,GZMH和耗竭系数呈现负表达关系，拟时序分析结果表明了在CD8+T细胞变化的连续阶段中会出现一个过渡的、中间态的CD8+ GZMK细胞类群，这个细胞类群高表达GZMK，同时具有stem-like和记忆T细胞所具有的标记。

● 6 GZMK expression delineates MAIT subsets in PT1

● 利用前面GZMK能区分CD8+T细胞的实验结果，进一步探究GZMK能否能够利用来区分其他细胞类型，实验者用GZMK区分MAIT这个T细胞亚群。

● 将细胞分为两大类

① MAIT GZMK：less exhausted, GZMK-expressing
② MAIT CTL：GNLY/GZMB cytotoxic genes

同时探究了治疗前后两种细胞比例。

● 实验发现CD8+ and MAIT GZMK细胞含有共同表达的基因如CD27, LTB, TCF7,EOMES，这些基因大多与白细胞的分化，钙信号（细胞因子分泌和细胞毒性）有关，尤其是钙信号能够调节T细胞分化和活化，是实现T细胞功能特异性，并调节细胞因子分泌和细胞毒途径的信号。

● 7 Shared clonotypes among T cell lineages

● 该部分探究了不同细胞亚群之间共享的配受体克隆型。

● 实验结果发现在治疗后，不同CD8+T细胞之间共享的配受体克隆型数量增加，这表明经过PD-1 blockade治疗后在密切相关的T细胞谱系中，共享克隆型扩大，因此T细胞能够更早的抗原启动和表型分化。

● 8 Chr7/7q loss is associated with resistance to ICB-based therapy

● 实验者通过CNV分析发现在NR样本中存在染色体chr7/7q区域缺失，缺失区域与mTORC1 signaling, glycolysis, interferon γ (IFNγ) Hallmarks pathways信号通路有关，实验结果证明chr7/7q缺失与免疫抑制微环境有关，chr7/7q的丢失似乎与Treg免疫细胞中富集的免疫抑制环境有关，这使免疫检验点治疗效果不佳。

Conclusion

目前在临床试验中，AML患者仅在使用PD-1治疗，在相关的治疗背景下，T细胞生物学、亚群和TCR基因序列对治疗的反应的认识存在差距，这些数据为深入了解T细胞和AML细胞的分子动力学建立了一个框架，从而制定最佳的治疗方法，以提高治疗的疗效和结果。

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