本文译自美国药典，药包材生物反应性体外测试。
<87>体外生物反应性实验
以下试验旨在确定哺乳动物细胞培养物与弹性塑料和其他高分子材料直接或间接接触的生物反应活性，或从试验材料中制备的特定提取物的生物反应活性。测试必须在指定的表面区域进行。当样品的表面积无法确定时，对弹性塑料按照0.1g/ml，塑料或其他材料按照0.2g/ml来计。处理材料务必小心，防止外源物质或微生物的污染。
以下描述了三个测试(琼脂扩散试验，直接接触试验和洗脱试验)。
*决定进行何种测试或进行多少测试以评估特定物质或提取物的潜在生物反应性，取决于材料、最终产品及其预期用途。其他可能影响样品用于特定用途适宜性的因素包括：聚合物的组成，加工和清洗程序，接触的媒介，油墨，粘合剂，防腐剂的吸收、吸附和渗透性以及储存条件。在确定由特定材料制成的产品是否适合其预期用途之前，应通过适当的其他的具体试验对这些因素进行评估。USP参考标准：USP高密度聚乙烯参考标准；USP 阳性生物反应参考标准。
细胞培养物制备：准备MEM/血清培养基培养的L-929 (ATCC CCL 1，NCTC 克隆 929，哺乳动物成纤维细胞)细胞，按照为105/ mL的密度接种。在37 ± 1°/5 ± 1%CO2培养箱中培养不少于，得到汇合度大于80% 的单层细胞。在显微镜下检查准备好的培养物，以确保均匀、接近融合的单层细胞。[注:体外生物反应性试验的可重复性取决于获得一致的细胞培养密度。]
提取试剂：氯化钠注射液(含0.9% NaCl的注射液)。也可以使用无血清哺乳动物细胞培养基或添加了血清的哺乳动物细胞培养基。提取完成24hr后方可添加血清。
设备
高压灭菌锅—可以维持121± 2°，装有温度探测器，压力计，排气阀，能够保证测试物位于水面以上，并配备有加热后可以使测试物降温至不低于20°的冷却系统。
烤箱：最好是机械对流型，可保持运行温度50°到70°（±2°）
培养箱：可以保证37 ± 1°/5 ± 1%CO2以及湿润空气的培养箱。
提取容器——安瓿瓶或螺纹管或者相当的I型玻璃容器。这些容器需用具有合适弹性衬垫的螺旋盖封闭。弹性衬垫的暴露面要使用厚度50到75
µm的惰性固体磁盘完全保护起来。聚四氟乙烯是较为合适的材料。
设备准备-用铬酸混合清洗剂彻底清洗所有玻璃器皿，如有必要，用热硝酸清洗，然后用注射用无菌水长时间冲洗。使用适当的工艺容器和用于提取、转移或管理测试材料的设备进行消毒和干燥。如果使用环氧乙烷作为杀菌剂，则允许不少于48小时完全脱气。
过程
样品或提取物制备：
样品的制备:选择表3所示大小的样本，并将其细分为若干部分。通过以下方法处理每个细分样品或阴性对照，去除颗粒物质，如棉絮和游离颗粒：将样品放入一个干净的、玻璃塞的I型玻璃100毫升刻度瓶中，并加入约70毫升的注射用水。搅拌约30秒，把水倒掉。重复一次，用植物油烘干待提取样品，烤箱温度不超过50°.【注意:请勿用干布或湿布或用有机溶剂、表面活性剂等漂洗或洗涤样品。】
提取物的制备: 将准备好的样品放在提取容器中进行测试，并加入20ml提取液。每个样品准备一个。在高压锅中加热60分钟，在70°的烤箱中加热24小时，或者在50°的烤箱中加热72小时。让容器内的液体有足够的时间达到萃取温度。【注意:提取条件在任何情况下都不应引起物理变化，如样品的融合或熔化，从而导致可用的表面药物产品区域减少。碎片的轻微粘附是可以接受的。始终将清洗后的碎片单独添加到萃取介质中。如果培养管用于植物油高压萃取，用压敏胶带适当地密封螺旋盖。](油样和空白)。
冷却至室温左右，但不要低于20°，剧烈摇晃几分钟，然后立即将每种提取物倒入干燥、无菌的容器中，并采取无菌措施。将提取物保存在20°~ 30°的温度下，24小时后不要用于测试。需要注意萃取介质与塑料有效表面积的接触，萃取过程中的时间和温度，适当的冷却、搅拌和倒瓶过程，以及萃取后对萃取物的无菌处理和储存。
*进一步的详细信息见：美国测试和材料协会，1916. PA 19103:“用于琼脂扩散细胞培养筛选细胞毒性的标准试验方法”，ASTM指定F 895-84；“直接接触细胞的医疗设备材料评估的标准实施规程”，ASTM指定f813 - 83。
哺乳动物细胞培养基为提取液。[注—如果37 °培养超过24 小时，使用添加血清的细胞培养液。提取条件在任何情况下都不应引起物理变化，如材料块的融合或熔化，除了轻微的粘附。
琼脂扩散试验
本测试适用于各种形状的弹性封闭材料。琼脂层保护细胞免受机械损伤，同时允许可浸出的化学物质从聚合样本扩散。将被测试材料的提取物涂在一张滤纸上。
样品制备-使用按要求制备的提取物或使用表面积不小于100 mm2的样品部分。
阳性照准备-按指导进行正对照准备。
阴性对照准备-按照样品准备的指导进行。
使用标准培养条件下制备的7ml细胞悬液，接种于若干60mm培养皿中。经过培养，吸弃培养基，更换为含有不超过2%琼脂的含血清的培养基。【注意：琼脂的质量必须足以支持细胞生长。琼脂层必须足够薄，以允许浸出的化学物质扩散。】将制备的样品、阴性对照样品、阳性对照样品平面置于适当的提取培养基中，与固化的琼脂表面接触，复孔测试。每块板不超过三个样品。标准条件下培养至少24hr。在显微镜下检查每个样品周围的培养物，必要时染色。样品的生物反应性(细胞变性和畸形)采用从0到4的评价标准(见表畸形1)。如果观察到的阴性对照样品的反应为0级(无反应)，阳性对照样品的反应至少为3级(中度)，则该细胞培养试验系统是适用的，否则重复上述步骤。如果样品制备的反应不大于二级(轻度反应)，则样品满足试验要求。
直接接触测试
适用于各种形状的材料。同时提取和测试可浸出的化学物质样品，适用于血清添加的培养基。这种方法不适用于可能对细胞造成化学损伤的低密度或高密度材料。
样品制备-使用表面面积不小于100 mm2的试样的部分。
阳性对照准备-按照样品准备的指导进行。
阴性对照准备-按照样品准备的指导进行。
使用标准培养条件下制备的2ml细胞悬液，接种于若干35mm培养皿中。形成单层后，从培养物中吸弃培养基，加入0.8 mL新鲜培养基。在每一个重复培养中分别放置一个样品制剂、一个阴性对照制剂和一个阳性对照制剂。标准条件下培养至少24hr。在显微镜下检查每个样品周围的培养物，必要时染色。样品评价同上。
洗脱测试
本试验是为评价聚芳族材料的萃取物而设计的。该方法允许在不同的时间间隔内，在生理或非生理温度下提取标本。适用于高密度材料和剂量依赖性反应的评价。
样品制备-使用氯化钠注射液(0.9% NaCl)或无血清哺乳动物细胞培养基作为提取溶剂。当样品的表面积无法确定时，对弹性塑料按照0.1g/ml，塑料或其他材料按照0.2g/ml来计。另一种方法是使用含血清的哺乳动物细胞培养基作为提取基质，模拟更接近的生理条件。
提取物放置于培养箱中预热24hr，不要超过37°，高温可能会引起血清变性。
阳性对照准备-按照样品准备的指导进行。
阴性对照准备-按照样品准备的指导进行。
使用标准培养条件下制备的2ml细胞悬液，接种于若干35mm培养皿中。形成单层后，吸弃培养基，加入样品提取物。样品不稀释，复孔测试。1：4稀释后重复测试。加入提取物后孵育48hr后，镜下检查细胞状态。系统确认同前。采用下表格评价结果。对于剂量依赖性反应评价，使用定量稀释的样品提取物重复这个步骤。
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