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CRISPRa基因过表达技术

CRISPRa基因过表达技术

作者: HyCyte海星 | 来源:发表于2021-11-05 14:55 被阅读0次

    上回说到,基因功能研究,最常用的策略就是功能获得和功能失活。基因过表达、基因干扰、基因敲除,这三板斧挥出去,配合下游的转录谱分析、表型分析,基因功能的神秘面纱,往往就能解开一角。

    基因过表达技术,通常是指将目的基因的ORF构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游,通过载体转入某一特定细胞中,实现基因表达量增加的目的,可以使用的载体类型有Virus-Free转座子载体,慢病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体等多种类型。当基因表达产物超过正常水平时,观察该细胞的生物学行为变化,从而了解该基因的功能。

    CRISPRa(转录激活),作为基因过表达技术的新成员,是通过催化失活的Cas9(dCas9)连上转录激活子,来实现促进基因组特定位点的转录。

    目前CRISPRa已经发展出好几个新版本。MIT的CRISPR先驱张锋通过改造dCas9和sgRNA优化了转录机器的招募,成功将RNA表达水平提升了一个数量级。张锋团队用自己的改良版CRISPRa激活了十个基因,研究显示,这些基因的转录都得到了两倍以上的增涨,许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。他们发现,CRISPRa离转录起始位点越近,转录激活的效果就越强。如果CRISPRa靶向转录起始位点的上游(超过200bp),触发的转录就会更为温和,更接近生理水平。通过这一途径揭示了基因表达量与表型强度之间的线性关系。

    加州大学的Jonathan Weissman研究团队在dCas9上融合了一连串短肽(也就是SunTag array),这些短肽相当于一套分子挂钩,能在细胞中招募多拷贝的转录激活子,生成强劲的信号。

    综合看CRISPRa(基因激活)系统是用于转录激活内源性基因的强大工具。完整的CRISPRa系统包含三个组分,每个组分分别由单独的载体提供:gRNA/MS2表达载体,MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。

    gRNA/MS2表达载体,包括两个138-nt发夹RNA适体,形成噬菌体MS2衣壳蛋白的结合位点。这些发夹RNA适体与gRNA连接,有利于高效募集MS2-融合蛋白。

    MS2/P65/HSF1辅助载体驱动由MS2,p65(NF-kB的反式激活亚基)和HSF1(人热休克因子1的激活结构域)组成的三结构域融合蛋白的表达。

    dCas9/VP64辅助载体驱动催化失活变体dCas9和合成型VP64反式激活结构域融合蛋白的表达。

    当这三种载体共转导细胞时,用户定制的gRNA可能会募集MS2/P65/HSF1(通过MS2结合发夹适体与gRNA连接)和dCas9/VP64(通过CRISPR/Cas9复合物组装) 到gRNA靶位点,从而组装出强大的SAM复合物。这些SAM复合物可通过VP64,p65和HSF1激活结构域之间的协同作用实现靶位点的强烈转录激活。

    该载体系统可用于激活单个或一系列基因的转录,也可用于基因组的大规模筛选,使用gRNA序列文库来产生gRNA/MS2表达载体文库。 

    Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.  

    J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi: 10.4014/jmb.1705.05081.

    CRISPRa vs ORF传统过表达技术

    相比于传统ORF稳转过表达技术,CRISPRa通过激活内源性启动子高效转录,从而促进基因表达,不需要额外构建外源性表达元件,不受基因转录本大小的限制。

    Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

    因此,CRISPRa技术在长转录本基因过表达研究、单基因多转录本的整体激活研究具有不可替代的优势。

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