CRISPRa基因过表达技术

上回说到，基因功能研究，最常用的策略就是功能获得和功能失活。基因过表达、基因干扰、基因敲除，这三板斧挥出去，配合下游的转录谱分析、表型分析，基因功能的神秘面纱，往往就能解开一角。

基因过表达技术，通常是指将目的基因的ORF构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因表达量增加的目的，可以使用的载体类型有Virus-Free转座子载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。

CRISPRa(转录激活)，作为基因过表达技术的新成员，是通过催化失活的Cas9（dCas9）连上转录激活子，来实现促进基因组特定位点的转录。

目前CRISPRa已经发展出好几个新版本。MIT的CRISPR先驱张锋通过改造dCas9和sgRNA优化了转录机器的招募，成功将RNA表达水平提升了一个数量级。张锋团队用自己的改良版CRISPRa激活了十个基因,研究显示，这些基因的转录都得到了两倍以上的增涨，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。他们发现，CRISPRa离转录起始位点越近，转录激活的效果就越强。如果CRISPRa靶向转录起始位点的上游（超过200bp），触发的转录就会更为温和，更接近生理水平。通过这一途径揭示了基因表达量与表型强度之间的线性关系。

加州大学的Jonathan Weissman研究团队在dCas9上融合了一连串短肽（也就是SunTag array），这些短肽相当于一套分子挂钩，能在细胞中招募多拷贝的转录激活子，生成强劲的信号。

综合看CRISPRa（基因激活）系统是用于转录激活内源性基因的强大工具。完整的CRISPRa系统包含三个组分，每个组分分别由单独的载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。

gRNA/MS2表达载体，包括两个138-nt发夹RNA适体，形成噬菌体MS2衣壳蛋白的结合位点。这些发夹RNA适体与gRNA连接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1辅助载体驱动由MS2，p65（NF-kB的反式激活亚基）和HSF1（人热休克因子1的激活结构域）组成的三结构域融合蛋白的表达。

dCas9/VP64辅助载体驱动催化失活变体dCas9和合成型VP64反式激活结构域融合蛋白的表达。

当这三种载体共转导细胞时，用户定制的gRNA可能会募集MS2/P65/HSF1（通过MS2结合发夹适体与gRNA连接）和dCas9/VP64（通过CRISPR/Cas9复合物组装） 到gRNA靶位点，从而组装出强大的SAM复合物。这些SAM复合物可通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同作用实现靶位点的强烈转录激活。

该载体系统可用于激活单个或一系列基因的转录，也可用于基因组的大规模筛选，使用gRNA序列文库来产生gRNA/MS2表达载体文库。 

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.  

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi: 10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPRa vs ORF传统过表达技术

相比于传统ORF稳转过表达技术，CRISPRa通过激活内源性启动子高效转录，从而促进基因表达，不需要额外构建外源性表达元件，不受基因转录本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技术在长转录本基因过表达研究、单基因多转录本的整体激活研究具有不可替代的优势。

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