期刊：Cell&Bioscience
影响因子：7.133
期刊：Cell&Bioscience影响因子：7.133
2021年5月派森诺携手华西口腔医院周学东老师团队在Cell&Bioscience （IF=7.133）期刊发表研究成果。本文通过X射线筛选了一株变异链球菌突变体#858，通过细菌重测的方法研究了主要致龋菌变异链球菌的基因组突变和致龋性变化，为辐射可以直接影响变异链球菌的表型和诱导毒力基因突变提供了有价值的信息，并提示接受放射治疗的患者除了要注意辐射引起的组织损伤外，还应警惕口腔病原菌的毒力变化。
研究思路
研究背景
放射治疗（RT）在头颈癌（HNC）的治疗中起着至关重要的作用，但是其可能会对头颈部周围组织产生不利影响，导致一系列副作用，如淋巴功能减退、放射性龋齿（RC）和粘膜炎。RC是放射治疗后的典型临床症状，可导致牙齿侵袭性破坏，咀嚼效能丧失、持续性慢性口轻感染和放射性骨坏死。放射治疗后口腔微生物的变化被认为是放射性龋病发生的病因之一。有研究发现致龋微生物种类包括变异链球菌属、乳杆菌属和念珠菌属等。以往的研究主要集中在放射治疗后口腔菌群的种类组成和丰度变化上，对口腔菌群的功能性质研究较少。其中变异链球菌在头颈部照射后牙菌斑的丰度显著增加，表明其在放射性龋病中起主要作用。然而，辐射对变异链球菌基因组和毒力的影响仍未被研究过。在本研究中，通过对变异链球菌进行X射线照射，然后分析其基因组的变化及其致龋性，以探讨X射线是如何直接影响口腔细菌的。
研究材料和方法
实验材料：变异链球菌野生型UA159X射线辐照后得到的变异链球菌突变体#858
测序平台：Illumina Hiseq
分析内容：qRT‑PCR、生物膜成像、细菌重测序、构建点突变菌株与敲除菌株、蛋白分离和SDS-PAGE、大鼠龋病模型实验等。
研究结果
1. X射线辐照对变异链球菌生物膜形成能力的影响
测试了变异链球菌对X射线的敏感性，发现其存活率随着X射线剂量的增加而降低（图1a）。在X射线对变异链球菌辐照后，变异链球菌悬浮液的生物膜形成能力明显高于对照组（p < 0.05），但各实验组之间没有显著差异（图1b）。为了探讨变异链球菌细胞的个体表型变化，从辐照样品中随机分离了147个变异链球菌单菌落，在这些菌株中观察到不同的生物膜形成能力（图1c），其中菌株#858的生物膜形成能力降低最为明显。这些结果表明，治疗剂量的X射线可以影响变异链球菌的毒力特性。
图1. X射线对变异链球菌细胞活力和生物膜形成能力的影响
2.菌株#858胞外多糖产量及生物膜结构变化
分离得到的147株菌种中，80Gy组分离得到了生物膜形成缺陷较多的菌株#858，其生物膜形成能力显著低于野生型菌株（WT），且其生物膜在结晶紫染色过程中极易脱落（图2a,b），这表明菌株#858缺乏正常的粘附能力和生物膜形成能力。#858和WT之间的生长率没有显示出显著差异（图2c），表明#858的生物膜形成缺陷与细胞生长能力无关。SEM分析和共聚焦激光扫描显示，与WT相比，#858的生物膜不仅稀疏得多，且几乎没有EPS（胞外多糖）分布（图2d,e,f,g）。进一步测量了EPS相关基因的表达，发现菌株#858的EPS生物合成基因（gtfB、gtfC、gtfD）均显著下调（图2h）。
图2.菌株#858生物膜形成能力降低
3. X射线引起gtfB基因同义突变
为了研究#858的生物膜形成缺陷是否由X射线引起的基因组突变引起，对#858进行了重测序分析。结果显示与WT相比，#858在gtfB上有3个同义突变位点（表1），包括c.2043T>C、 c.2100C>T、c.2109A>G，分别编码异亮氨酸、精氨酸和精氨酸。基于密码子使用数据库中变异链球菌UA159的密码子使用频率，发现突变的密码子c.2043T>C在转录水平上从AUU变为AUC，其使用频率从53.4‰下降到15.9，而另两个突变位点则前后无明显差异，这可能是#858生物膜形成能力丧失的原因。
表1. 菌株#858相比野生型UA159所具有的基因突变
4.同义点突变菌株gtfB 2043T>C降低了EPS的产生和生物膜的形成
通过同源重组构建了一株点突变菌株gtfB2043T>C，同时构建了gtfB敲除菌株ΔgtfB作为对照。图3可以看出，与菌株#858相同，突变菌株gtfB2043T>C和ΔgtfB菌表现出生物膜形成相较WT减少且不完整（ΔgtfB生物膜几乎完全脱落），这三株菌几乎不具有细胞外基质，同时生物膜厚度和EPS显著降低。尤其重要的是，与WT相比，这三种菌株中gtfB的表达显著下调。为了研究gtf基因转录的变化是否会影响酶的产生，对Gtfs蛋白进行研究。结果表明，所有组的GtfB/D均从GtfC中分离出来，其中，与WT相比，#858、gtfB2043T>C和ΔgtfB的GtfB/D带显著降低。Gtf酶的蛋白表达表明，gtfB的“沉默突变”不仅降低了gtf基因的转录水平，而且降低了Gtf基因的蛋白水平。
图3. 点突变菌株gtfB2043T>C可以降低EPS的产生及生物膜的形成
5. 同义突变体C.2043T>C体外抑制牙齿脱矿
为了验证同义突变c.2043T>C引起的GTFB降低是否会影响脱矿能力，分别使用使用横向显微照相（TMR）测试变异链球菌菌株的脱矿效果。处理72h后，所有变异链球菌均引起明显的釉质脱矿。其中三个菌株#858、gtfB2043T>C和ΔgtfB的矿物质损失和病变深度显著低于WT，而他们三者间无较大显著差异（图4）。
图4.点突变菌株gtfB2043T>C可以抑制牙釉质脱矿
6.同义突变c.2043T>C体内致龋性降低
比较了变异链球菌菌株在体内的致龋能力，发现感染小鼠的变异链球菌中，WT定植水平显著高于其他三组，表明gtfB基因突变可抑制口腔环境中变异链球菌的定植。与WT相比，感染#858、gtfB2043T>C和ΔgtfB的小鼠龋病发生率和严重程度显著降低（图5，表2）。
综上所述，gtfB基因的同义突变c.2043T >C在体外可减少牙齿脱矿，在体内可降低变异链球菌的致龋能力。
图5.gtfB基因的同义突变可降低变异链球菌的致龋能力
表2.鼠龋齿评分（Keyes评分）
研究结论
本文首次研究了主要致龋菌变异链球菌在X射线的治疗剂量照射下其基因组突变和毒力变化。研究发现治疗剂量的辐射可以直接影响变异链球菌的表型并且分离到了一株生物膜形成缺陷突变体#858，该突变体在体外和体内均表现出胞外多糖生成能力、生物膜形成能力和致龋能力的降低。重测序结果表明，#858只有三个同义突变，gtfb基因的C.2043T>C的“沉默突变”可导致所有gtfs基因的表达下调，减少gtfb酶的分泌，而不会因密码子偏向而影响生长。由于密码子使用频率的不同，基因组的同义突变对基因表达和相关蛋白的翻译都是可以忽略的因素。该研究为辐射可以直接影响变异链球菌的表型和诱导毒力基因突变提供了有价值的信息，并提示接受放射治疗的患者除了要注意辐射引起的组织损伤外，还应警惕口腔病原菌的毒力变化。
本研究的细菌重测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
文章索引：Wang Z, Zhou Y, Han Q, et al. Synonymous point mutation of gtfB gene caused by therapeutic X-rays exposure reduced the biofilm formation and cariogenic abilities of Streptococcus mutans. Cell Biosci. 2021;11(1):91. Published 2021 May 17. doi:10.1186/s13578-021-00608-2
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