不同于动物可以主动逃跑躲避危害，植物无时无刻不与周遭的病原物作斗争。在长期的进化历程中，植物细胞膜拥有了pattern recognition receptors(PRRs)以识别来自外部的病原物信号。与此同时，植物细胞内也进化出了 nucleotide-binding, leucine-rich receptors (NLRs)来识别分泌到植物细胞内的病原物effectors。在这其中，植物抗病小体ZAR1就是一类NLR蛋白。今天我们分享一篇来自Plant Cell的文献，窥探抗病小体ZAR1从创业到发家的全过程。我们也可以从中思考用生物信息学研究植物免疫学的思路和方法。
文章信息
- 题目：The origin and evolution of a plant resistosome
- 期刊和时间：Plant Cell，2022.2.8
- 作者和单位：通讯作者为南京师范大学韩管助教授和中科院遗传发育所周俭民研究员。
研究背景
- 目前已经有ZAR1同源性的报道，但是对于ZAR1起源与系统进化过程仍然未知。
研究结果
1.ZAR1起源于基因复制
由于植物基因组中NLRs和RLKs/RLCKs的拷贝数比较大，作者在72个代表性植物中进行了针对全基因组的蛋白相似性研究。即在众多植物基因组中，对AtZAR的NB-ARC区域进行BLASTp检索。采取的工具是HMMER。同时对AtRKS1的激酶域进行BLASTp检索，采用的工具是MAFFT。最终将72种植物全基因组建树，并附加BLASTp检索信息，如图1。
当然在一些植物中，BLASTp可能检索不到ZAR或者ZRK的相关蛋白。为了更加严谨排除这部分植物基因组，作者采用了tBLASTn来验证这部分植物基因组是否真的没有。采用tBLASTn检索到的区域也会被统计入相关蛋白，并且通过TMHMM预测跨膜结构域。用此法又补充了7个ZAR1-related protein。
Figure1|ZAR1 和ZRK相关蛋白在植物基因组中的分布。这里由于原图太长，只截取了一部分。BLASTp比对结果通过右侧的空心圆和实心圆表示，实心代表比对上了，空心则没比对出来。实心圆旁边的数字代表对应蛋白在相应植物基因组中比对上的个数。星号代表用 tBLASTn检索出来的相关蛋白。
ZAR1-sis，ZAR1-basal与ZAR1看上去既熟悉又陌生，那他们到底是什么呢？
作者构建完上述全基因组系统发育树后，针对 ZAR1和 ZRK相关的全长蛋白也进行了单独的系统发育分析。根据各个蛋白对于AtZAR1的关联程度，即在系统发育树位置，将蛋白分成了 ZAR1， ZAR1-sis， ZAR1-basel。在图2中用了不同颜色的枝子表示出来，其中灰色枝是外群。
Figure 2|ZAR1相关蛋白的系统发育树。这里采用了MAFFT软件的L-INS-I strategy进行序列比对，IQ-TREE的最大似然法建树。右侧的彩色横条代表对应蛋白的结构信息。完整的ZAR1具备N端CC域，NB-ARC域以及LRR域
上述两个分析表明ZAR1起源于基因复制，发生于在双子叶和单子叶的最后一个共同祖先之前。此外，ZAR1分化出的三个群（ZAR1， ZAR1-sis， ZAR1-basel）各自也有着不同的演化方式。多种植物存在着多个ZAR1相似蛋白的拷贝，但只保留了一个结构完整的ZAR1基因。也就是说ZAR1在经过基因复制之后又很自觉地恢复到单拷贝状态。
那么在了解ZAR1源于复制之后，作者就要探讨为什么有些ZAR1的copy保存下来，而有些则消失了。因此作者评估了ZAR1相关蛋白进化过程中受选择情况。将刚刚得到的三类ZAR1相关蛋白分别组成新群体并计算了蛋白全结构域范围内的dN/dS，也就是非同义替换比同义替换的比例。在其中我们最熟悉的ZAR1 dN/dS小于0.25，表明ZAR1群体受到了纯化选择，如图3A。而ZAR1-sis和ZAR1-basel经历了更少的纯化选择。由于ZAR1执行抗病小体功能要与RKS1进行互作，因此作者把关注点随后放在了RKS1互作域上。
dN/dS或者叫做Ka/Ks
代表着同义突变和非同义突变的比例。同义突变代表着不导致氨基酸种类改变的突变，非同义蛋白则是氨基酸发生改变的蛋白。一般来说，同义突变不收到自然选择的影响，非同义蛋白则受到自然选择的作用。该比值可以判断是否有压力作用于该蛋白。如果：
Ka/Ks > 1, 该位点受到正选择；
Ka/Ks = 1, 该位点受到中性选择；
Ka/Ks < 1, 该位点受到纯化选择；有时候也认为小于0.25时，受到纯化选择。
Figure 3| ZAR1相关蛋白进化群dN/dS及其与AtRKS1互作位点的氨基酸偏好情况（ Sequence logos图）。
注解：dN/dS图中三类蛋白模式图上方蓝色竖杠代表负选择位点，下方的红色竖杠代表正选择位点，n代表进行Ka/Ks分析的蛋白数量。B是三类蛋白与AtRKS1互作位点的氨基酸偏好情况。红星位置会影响二者互作结合，而红色标记的位点是受到负选择的位点。
除了AtRKS1互作区域，ZAR1执行功能还与其N端结构息息相关，因为N端要上膜成为离子通道（这一部分可以参考21年周俭民老师发表的Cell：The ZAR1 resistosome is a calcium-permeable channel triggering plant immune signaling）。因此作者对ZAR1的N端也进行了相似的处理，如图4EF。至此，作者从ZAR1相关蛋白的整体结构，RKS1互作域结构，N端结构分别进行了香农熵和Ka/Ks计算，得到了各个功能域的保守性情况。
Figure 4| ZAR1相关蛋白N端位点的氨基酸偏好及香农熵。
注解：作者计算了三类蛋白的香农熵，我们都知道熵衡量的是事物的混乱性。而对于蛋白而言，其位点可变化的程度越高，香农熵应当越大。而对于未经过选择的位点来说，这些位点的可变性要高于受到纯化选择的位点。在此处，作者计算氨基酸位点香农熵并绘制了箱线图进一步验证了ZAR1-sis与ZAR1-basel在AtRKS1互作区域内含有更多的可变位点，因此经历了更少的自然选择。图4D是ZAR1相关蛋白与AtRKS1互作域的香农熵，F是ZAR1相关蛋白在N端结构域的香农熵。
2.ZRK起源于基因复制WAK蛋白的细胞外域丢失
对于ZRKs的研究作者也采用了类似的分析方法，我们直接上图解释，图5。
Figure 5|ZRKs相关蛋白在系统进化关系。
注解：A图中的进化树是通过ZRKs相关蛋白的激酶域序列，采用ML法构建的。ZRKs相关蛋白在系统进化关系上位于WAKs（wall-associated receptor kinase， 一种RLK）分枝内。进一步查阅文献发现，WAKs存在保守的催化motif，然而ZRKs并没有。结合二者的进化关系，作者认为ZRKs起源于WAKs的细胞外域丢失。B图细化了ZRKs分枝，并且将各个分枝注释了相应的物种。结果发现同一植物的ZRKs可能会落在不同的分枝Lineage之中。从而表明ZRKs经历了复杂的进化历史。
3.ZAR1的直系同源基因导致其引发cell death
在这之后，为了调查ZAR1与ZAR1-sis和ZAR1-basel功能性的差异，作者聚焦了10种代表性植物，共18种（10个ZAR1直系同源, 7个ZAR1-sis，1个ZAR1-basel。后两者属于ZAR1旁系同源）ZAR1蛋白。并且将其分别转入zar1突变体中，观察其弥补zar1突变体缺陷并诱发原生质体cell death的能力。当然，引发cell death还需要转入PBL2，AVRAC和RKS1，结果如图6。
Figure 6|ZAR1相关蛋白的功能分析及其诱导cell death情况。
注解：图6是一张功能分析大图。其中6A汇总了其余小图的结果，也包含了寡聚和PM association信息。可以直接在这里简单浏览。图6B是细胞活力检测，低的代表引发了cell death。cell death实验也在烟草中进行了验证。
当然对于ZAR1与ZAR1-sis和ZAR1-basel诱发cell death的差异，作者针对ZAR1与ZRKs的互作和ZAR1的寡聚分别解释了其原因。图7是一张大图组合了多个CoIP结果，在前面对于CoIP已经多提提到，这里的结果也很容易理解，故而只放了其中的A图。以说明ZAR1直系同源与旁系同源蛋白与ZRKs互作情况不一致。图8也是一张大图组合了多个ZAR1寡聚分析结果，以说明ZAR1直系同源与旁系同源蛋白的寡聚情况不同。此处使用的胶是native-PAGE。在RKS1的诱导下，ZAR1寡聚使得其整体分子量增大，跑胶置后。而native胶能够保留其寡聚状态，从而在跑胶过程中以其分子量差异反映寡聚状态。互作分析和寡聚分析解释了ZAR1与ZAR1-sis和ZAR1-basel诱发cell death的差异。
Figure 7|ZAR1相关蛋白与ZRK相关蛋白之间的互作分析。
Figure 8|ZAR1相关蛋白的寡聚分析。
总结
本研究结合了系统发育学以及生物化学分析，是生信与实验结合的典型工作。生信部分最核心分析是ZAR1相关蛋白和ZRK相关蛋白的系统发育分析，而生化部分则是ZAR1相关蛋白的cell death分析及其表型差异原因解析。二者相辅相成，实现了1+1>2。关注分子进化的伙伴建议精读原文。
参考信息：
1. Zhen Gong, Jinfeng Qi, Meijuan Hu, Guozhi Bi, Jian-Min Zhou, Guan-Zhu Han, The origin and evolution of a plant resistosome, The Plant Cell, 2022;, koac053
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