理解和探索肿瘤异质性 —NatureMedicine会议纪要
一． 肿瘤进化
什么是克隆？什么是驱动者？肿瘤异质性的来源是什么，异质性对肿瘤进化的有什么贡献？肿瘤异质性如何能在临床前实验建模？
二． 基因组之外的信息
表观基因组对肿瘤表型和临床结果的贡献是什么？为了描述和理解异质性和肿瘤微环境的影响，我们应该采用什么方法以及采集什么样本？肿瘤如何增加免疫原性？
三． 临床和监管方面的考虑
肿瘤异质性从哪些方面影响临床，以及如何将其转化成诊断策略和治疗指南包括治疗反应的生物标志物？如何最大化的提取共享的分子和临床数据从而使病人受益？肿瘤异质性如何被设计于用药？为什么临床试验会失败，临床试验的未来会如何？
四． 技术
通过分析DNA数据，哪种来源的异质性可以被检测，而哪些很难被评估？关于DNA关于蛋白如何评估肿瘤的空间组成？哪些无创或者微创技术可以获得肿瘤异质性的信息？如何建立和验证评估异质性的标准流程我们如何应用科技评估异质性的临床影响
肿瘤异质性是一个研究人员才刚刚开始了解的新的研究主题。遗传学的和表观遗传学的异质性如何影响肿瘤的进化和临床进展还是未知的。微环境因素对于异质性的影响也还有待确定。Nature Medicine, Nature Biotechnology和大众基金会组织了这次会议，聚焦于推动肿瘤异质性转化研究目前面临的困难。再这些关键问题明确了之后，与会者设计了可能的解决方案。他们的观点展示如下。
在很多肿瘤中，分子和细胞水平的肿瘤异质性存在于同一种肿瘤中，包括同一个病人同一肿瘤的不同位置以及不同病人的同一种肿瘤。这使得研究人员难以理清肿瘤进化的思路，也影响到他们设计和选择有效的治疗方案以及应对出现的耐药性。
研究者目前还处在对于肿瘤异质性的全面理解的初期，包括肿瘤微环境对异质性的影响到底有多大，哪种类型的肿瘤异质性以及肿瘤异质性的哪些方面影响了哪一个类型的肿瘤或者与哪种临床具体情况相关？如何探索肿瘤异质性以达到临床增益的效果？
为了研究这些关键问题，Nature Medicine, Nature Biotechnology和大众基金会邀请了全球20位科学家在德国汉诺威宫殿参加了为期两天的头脑风暴式的会议。为了广泛征询意见，与会的专家包括计算生物学家，技术研发专家，癌症生物学家，临床医师，行业代表和监管机构。主要的目的就是为了确定关于肿瘤异质性最重要的问题以及解决肿瘤异质性问题的方案。我们希望在会议上建立的网络合作能最终使得解决方案得以实现。
所有与会者认为广泛共享团队间的发现是最关键的，尤其对于那些公认的最重要的问题。这次会议的组织模式和目的就在于此。会议的第一天所有的与会者就最重要的问题进行头脑风暴，第二天分成四个小组进行讨论，分别是“癌症进化”、“除基因方面之外其他的因素”、“临床与管理”和“技术”。会议第二天的最后，每一小组向大会汇报了他们的总结。提出问题然后解决问题环节正是此次会议的亮点所在。
一． 肿瘤进化
肿瘤异质性的很多生物学因素都是未知的，但是小组主要集中于基于我们可以定义和研究的肿瘤进化参数建立基本的前提。
什么是克隆？
克隆的概念已经广泛应用，但是在这一组的讨论中发现，也许令人惊讶的是，对于它的具体定义其实没有一致的定论。事实上，这个问题在会议上引发了一些最热烈的讨论。假设认为肿瘤是起源于一个单个细胞，那么这个肿瘤被认为是一个克隆，基于这个假设，起始突变存在于每一个肿瘤细胞中，被称为CCF（cancer cell fraction肿瘤细胞分数）为1。CCF<1的细胞组成的肿瘤称为亚克隆。事实情况是即便一个特定的突变出现在一次活检中，CCF为1，但是在接下来的肿瘤采样中可能部分或者完全检测不到这个突变。
什么是驱动者？
肿瘤驱动者这个词通常是指与肿瘤发生或者发展相关的基因事件。尽管传统意义上，它被认为是肿瘤细胞的自我改造促进了肿瘤增殖。经过此次会议讨论，大家认为将这个定义扩展到包括更多的促肿瘤发生复杂的生物因素会更有意义。换句话说，广义的“肿瘤驱动者”的生物学定义为发生细胞自主或者非自主的改变可以发生在肿瘤进化中的任何时期，包括起始、进展、转移和对治疗产生耐药性期间，通过改变来实现增值、存活、入侵或者产生免疫逃避等功能。这种改变可能是直接的突变事件的结果，包括遗传和表观遗传学事件，或者是在一个或者多个驱动者调节器和同源绑定的配体的异常信号和突变。候选驱动者可以通过很多方法来鉴别，包括对遗传和表观遗传的改变进行统计学分析，功能筛选和分析调控网络。但是这些分析必须得到实验证据的确认，包括临床前的体内体外数据和临床数据。更为复杂的是，作为肿瘤驱动者的角色是会随着时间和部位发生变化的。基因事件在肿瘤发生过程的一个阶段是驱动基因，在另一个阶段则可能不发挥作用，反之亦然。
肿瘤异质性的来源是什么，异质性对肿瘤进化的有什么贡献？
异质性主要是由两个主要因素导致的：1）遗传（或者表观遗传）改变介导发生的，比如：基因组不稳定；2）进化选择。值得注意的是，尽管进化是基于其适应性的表型选择的驱动，并不是所有的体细胞突变都有表型性状，甚至只有极少量的有一点适应优势。表型改变的选择可以有利于细胞的生长与表型相关的遗传改变。因此，在对癌症进化的研究过程中，可能是通过功能筛选联合多维表型分析（研究信号通路、表观遗传、转录、代谢以及其他非基因组变异方面的改变）将会提供最有用的信息来揭示驱动肿瘤发生的表型来源。产生和解释这些数据是很重要的，后面将会介绍和解决这些问题相关的未解决的技术问题。关于肿瘤异质性的贡献，尽管肿瘤异质性广泛被认为是肿瘤克服进化压力的特征，但是同时也意味着异质性本身可以被开发为治疗的靶点。这也使得去开发肿瘤异质性的量化技术以及模型显得更加重要。
肿瘤异质性如何能在临床前实验建模？
异质性是肿瘤进展的特征之一，然而在评价异质性所提供的动态性贡献时存在的挑战之一是临床前的肿瘤模型不能重复模拟异质性肿瘤在人体内发生和进展的情况。GEMMs小鼠模型在揭示肿瘤生物学的关键方面是一个很有利的工具，但是出于伦理学的问题，小鼠内的肿瘤只允许在体积较小的时候分析。此外，肿瘤负荷、转移潜能和肿瘤本身的寿命也无法在小鼠模型中模拟。需要新的研究技术来应用于解决这些问题。CRISPR-Cas9技术与GEMMS模型联合研究将会有助于模拟人体内肿瘤进化过程中积累的基因组的复杂性。PDX小鼠模型至少在初期模拟了病人样本的异质性。然而，亚克隆在小鼠体内可以通过被选择来增加其适应性以便增值，而这一过程缺乏合适的微环境和免疫组分来影响亚克隆的选择（PDX模型应该使用的是裸鼠）。持续得努力去构建拟人的老鼠模型对细化人的肿瘤进化的具体特征很有帮助。但是老鼠和人的寿命和大小不同，加上老鼠实验过程中遇到的伦理问题，也许会限制这种人类疾病模型的应用。在动物模型中，诸如肿瘤切片培养的体外的方法可以用来在其自然环境中简单概括肿瘤的情况，organoids可以用于模拟人类细胞肿瘤模型。使用多尺度参数的硅片模型也可以用于建设有趣的可以用实验去证实的假说。但是由于没有一个模型是完美的，很多人认为没有比在病人身上研究肿瘤进化更有意义的了。
二． 基因组之外的信息
表观基因组对肿瘤表型和临床结果的贡献是什么？
细胞状态是每一个肿瘤细胞中的基因组，表观基因组，转录组和蛋白组相互影响的综合结果。应该停止孤立的分析遗传和表观遗传对于细胞状态的贡献，因为它们的影响的相互作用的。研究者应该致力于通过整合数据集来分析相应的细胞状态，才有可能针对该细胞所处的状态制定治疗策略。由于表观遗传修饰是动态的而且随时响应环境的压力，因此表观遗传的信息可能在影响细胞状态的方面发挥了关键的作用，而且会在治疗的任何时候产生响应。正是由于表观遗传的信息是动态的，所以它记录了肿瘤发生发展的历史：细胞曾经经历过的状态，会留下表观遗传学的标记，同时该标记记录了肿瘤响应微环境和治疗的压力。所以，表观遗传学标记在提供过去、现在和将来的细胞状态的信息方面有独特的优势。由于肿瘤的表观遗传学状态相对于正常发育来说更具有可塑性，这一领域可能对于理解表型转变例如EMT转化，基于原发部位和药物耐受导致的扩散潜能起到关键作用。
为了描述和理解异质性和肿瘤微环境的影响，我们应该采用什么方法以及采集什么样本？
为了更好的理解肿瘤微环境对于细胞状态的影响，研究者应该同时研究肿瘤和临近基质的DNA序列、表观遗传组、转录组、蛋白质组、代谢组和浸润免疫细胞。评估单细胞的数据将会给肿瘤异质性的研究提供更多的认知。只有通过这样的数据集成，包括统计学、机器学习技术或者分析调节或型号模型，我们才可以对癌症有更加深入的了解。因此也将继续增加对生物细信息学家的需求。相关的技术将会在下面的部分做进一步的讨论。
肿瘤如何增加免疫原性？
免疫原性部分取决于突变导致产生的抗原决定簇，而这种抗原决定簇不能被肿瘤浸润T淋巴细胞识别。所以包括过继T细胞疗法和免疫检查点抑制疗法在内的通过产生突变和改变免疫微环境的化疗和其他基因毒性的药物会促进免疫治疗的干预的效果。然而，目前还不清楚是否在免疫原性亚克隆的变化足以导致整个肿瘤被免疫系统消灭。在检查点阻滞前应用放射治疗可能会增加疗效。个别案例证实这种治疗的远端效应，但是这还没有在临床随机试验上进行证实。
三． 临床和监管方面的考虑
肿瘤异质性从哪些方面影响临床，以及如何将其转化成诊断策略和治疗指南包括治疗反应的生物标志物？
目前为止对于异质性如何影响临床病人的管理还没有一致性的共识。需要完成更多的工作去完成针对每种肿瘤亚型的详细图谱。目前的讨论认为已有的肿瘤基因组数据库不适合做这种分析，因为这些项目不是设计用来分析肿瘤异质性成分的，而且这些平台批量的描述肿瘤,给出的结果是所有肿瘤克隆的平均值。理想的情况是，研究者应该能得到每个肿瘤的多个区域以获取空间上的异质性。为了区别亚克隆的突变，每个区域应该得到深度测序。表观遗传学及其他的分析也应同时进行。肿瘤供体病人应该长期追踪，他们的组织，如果可能的话还包括血液样本应该定期收集并进行深度测序以追踪分子变化。在每一步中，样品和表型相关的临床注释是必不可少的，这种分析可以揭示有限数量的克隆和亚克隆突变，由此可以分析每个肿瘤类型所涉及的信号通路。
肿瘤进化
如何最大化的提取共享的分子和临床数据从而使病人受益？
在临床收集样本前和分析数据前，所有的利益相关者应该至少就以下方面达成一致：每一个肿瘤的收集的原始数据应该以能共享的格式；对肿瘤亚型的描述方法必须系统的和不可知的。基因组，临床和其他方面的数据一旦收集，必须添加到一个合适的数据库，并且在商定的时间表内完成。
肿瘤异质性如何被设计于用药？
虽然联合用药的研究充满挑战，设计用于测试基于某种特定肿瘤的分子信息的靶向化疗和/或免疫治疗的临床试验仍是必须的。无论这些联合用药是从一开始就使用还是后续才联合使用，新的耐药性和新的亚克隆突变都能在整个病程追踪的以非侵入性采集的病人样本的分析中发现，而这些分析结果取决于每种肿瘤的亚型的路线图和每种药物或者联合用药的治疗窗口期。
为什么临床试验会失败，临床试验的未来会如何？
通常某种药物的临床试验是针对有特定生物标记物的人群进行的，但是都不能提供异质性影响的信息以及克隆或者亚克隆细胞的长期追踪进化信息。缺乏反应的原因，无论是针对群体还是个人的试验，都要考虑肿瘤在空间和整个病程时间跨度的异质性。理想情况下的临床试验，应该能实时的，频繁的监测响应治疗过程中肿瘤进化所产生的分子变化，这将需要收集原发部位、转移部位的样本或者血液样本中的核酸或者细胞。
微环境
四． 技术
通过分析DNA数据，哪种来源的异质性可以被检测，而哪些很难被评估？
目前对批量样本进行高通量DNA测序是常用的技术用来进行肿瘤异质性分子特性的研究手段，高频的单核苷酸和结构变异在达到一定测序深度时可以被检测到。但是对于检测突变频率低于12%的突变，要求测序深度达到400500X对于大规模的研究来说仍是难以达到的。
单细胞基因组测序不仅可以检测肿瘤样本中单个突变位点的频率，还可以检测共发生或互排斥的改变。单细胞基因组测序可以研究极少数亚群的瘤内异质性例如循环或者扩散的肿瘤细胞。但是单细胞基因组测序的主要限制在于它的低通量和高昂的价格，不能覆盖基因组的全部，不一致性以及其他技术问题。此外，针对单细胞基因组测序的单核苷酸突变，插入和缺失，拷贝数信息和结构变异数据的算法也还没有建立，这是迫切需要解决的，因为数据存在着内在差异。
关于DNA
测序现在是研究肿瘤RNA结构的首选方法。不同于DNA，很难利用不同个体的RNA测序数据来分析肿瘤异质性，除非是来自同一个个体不同部位的肿瘤。
单细胞RNA-seq随着与Drop-seq的合并成为一项强大的技术，但是对于低表达量的基因仍然需要改进RNA-seq的实验步骤和方法来控制扩增过程的偏差和技术噪音，而且对于单细胞RNA-seq的数据分析方法需要形成标准程式。目前，单细胞方法对于获得全长RNA序列或者RNA修饰的信息还比较困难，且目前下一代测序平台的通量也还不足以测成千上万个单细胞。
由于转录组处在高度动态的状态，所以获得高质量转录组的样品处理非常重要。需要注意的方面包括样品从病人身上取下后被冷冻的速度有多快，更重要的是这些细胞如何从固体瘤体上被分散。新鲜的或者快速冷冻的样本的获得是必须的，FPPE样品可以处理用来进行RNA-seq但是可能对于癌症细胞状态不能提供可信的信息，而且由于片段化的天然特性导致结果不能提供完整有效的关于基因方面的信息。
低的假阳性或者假阴性率对于群体研究的影响有限，但是会导致相关突变信息出现人为导致的差异以及对研究结果出现严重的错误分析。目前需要的是独立的系统性的评估用于做突变分析的癌症样本，应该对于克隆组成有一套金标准的评估流程。我们已建立评估组织，用于改进癌症基因组测序数据突变分析方法，希望能够提供更好的处理全基因组数据集的分析方法，并进一步研发用于评估亚克隆突变和等位基因突变频率的标准程序。保守估计，要分析不同肿瘤样本之间的异质性程度，至少要使用大于60X 覆盖阈值和使用多个正常样品作为参照来过滤突变。还有一个未知的领域是如何确定标准来区分来自同一克隆起源的不同样本之间的相似性和不同，比如来自同一病人同一肿瘤的处理前和处理后样本，或者肿瘤异种移植模型系统的样本。
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蛋白质的研究技术落后于核酸分析，特别是在灵敏度和全面性方面。基于蛋白质组学使用质谱分析的方法进行蛋白质含量的总体检测，但是因为需要较大的样本量，因此使得很多肿瘤样品的蛋白质组学研究难以实施。当样本材料有限时基于抗原抗体反应的技术是其中一个选择，但是该类技术的限制是它的通量低以及高质量的抗体通常不容易获得。在单细胞水平已经可以达到非常高的通量，比如荧光剂或细胞分选（FACS）可以分析17个蛋白/细胞，质谱流式细胞技术（CyTOF）可以分析45个蛋白/细胞。随着CyTOF的发展，更多的蛋白可以被监控，但是没有可以提供单个细胞广泛真实反应蛋白谱的技术。关于蛋白
蛋白容量本身相对于转录组或者表观遗传组来说动态程度较低，所以对于样品新鲜度的要求稍低，但是对于理解癌症的信号通路非常关键的磷酸化修饰信息，却比转录组的敏感性更高也变化更快，对样品的收集处理过程要求很高。FFPE样本可以用来研究蛋白质组，但是不适合做FACS和CyTOF。
染色质的表观遗传特征，包括组蛋白修饰，DNA水平的甲基化和羟甲基化修饰，可以同时提供细胞状态和肿瘤进化史信息。目前的技术已经可以提供大多数基因组范围的表观遗传标志的图谱。ChIP-seq可以应用于分析非常小的样本（甚至小于1000个细胞）。全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），沉淀技术（甲基化DNA免疫共沉淀测序和甲基化DNA结合结构域测序）或者简化的表观亚硫酸氢盐测序技术（RRBS）都已经可以广泛使用。
某些细胞水平的异质性可以使用大量的DNA甲基化实验来获得，单个细胞的实验，虽然受限于通量，但是可以提供异质性和表等位基因的共生和相态的信息。 如何评估肿瘤的空间组成？
通常情况下，当理论上的空间异质性高于实际操作可以达到的程度，对于空间异质性的预判只能受限于基于镜检的方法，例如免疫荧光和荧光原位杂交可以用于定位蛋白质，组织切片用于高灵敏度检测RNA和DNA突变有可能降低到分子水平。然而，在实际应用中，这两种方法都存在量化表达水平和比较不同样品结果的困难，原因是这两种技术都有不同的背景和靶信号过弱的问题。其次，这两种技术还存在通量很低的问题。位点特异性表观遗传修饰的成像技术不是常规做的，尽管至少有一种技术已经发展到可以实现在固定组织上的组蛋白修饰可视化了。
近些年新技术的联合应用，可以在一定程度上评估蛋白和RNA表达的空间异质性。CyTOF可以通过图像定位32个蛋白，对于RNA，原位测序方法可以提供固定组织的不同细胞的RNA含量信息。这些技术的实际应用尚处于起步阶段，一个关于重复性和灵敏度的全面的基准测试尚未完成。现阶段，这些新技术的通量也还是受到限制的。
随着这些新技术的涌现，关键的瓶颈是发展分析每个技术的方法，使不同技术得到的信息整体化，并将这些数据和预后以及可操作的临床信息联合起来。
哪些无创或者微创技术可以获得肿瘤异质性的信息？
目前，血液样本是分析肿瘤分子信息的最好样本来源，它可以不通过穿刺肿瘤本身得到。Cell-free DNA和CTCs尤其富集了相关信息。一些高质量的研究已经开始评估如何分析血液来源样本的数据得到反应肿瘤的生物标志物。目前还不清楚原发或者转移的肿瘤对于循环肿瘤物质的贡献有多少。可以确定的是即使循环物质可以反应肿瘤本身，仍然需要发展更有效的方法从血液中分离细胞和核酸，以及更有效的数据分析方法可以更加真实得重建母瘤。
尽管体外影像学技术不能提供瘤内异质性的信息，但是影像学辅助的活检可以为基因组范围的瘤内异质性提供重要的帮助，因为它可以提供不同区域的空间信息。
如何建立和验证评估异质性的标准流程
建立和验证评估异质性的准确性和可靠性的方法首先需要发展样品收集的金标准。对于一些数据类型，例如DNA突变，简单的混合细胞系就可以，但是对于表观遗传或者RNA表达的数据，对微环境的变化非常敏感，从而需要对样本进行更多生物学变异的内参的测试，例如spike-in standards。对于每一个实验，采用一组质量指标，可用于评估改进的方法，研究者可以应用到自己的必须保持一致的实验中。
需要记住一点，了解生物学和形成临床诊断决策的所需的准确度也许是不同的，应该单独研究。
我们如何应用科技评估异质性的临床影响。
尽管已经有大量的实验数据和计算机分析数据，我们对一个关键参数仍缺乏清楚认识，就是需要检测以及整合哪些数据来评估肿瘤异质性对临床结果的影响。解决这一关键问题的开端，很明确的就是针对不同的实验对样品从收集到处理过程到合理的安排实验有严格的控制标准。
在设计实验研究肿瘤异质性和进化的临床影响时还有其他问题需要认真考虑。首先，要选择哪种肿瘤类型？肿瘤应该相对较大（以便为后续各种实验提供足够的材料），应该已经被切除并且可以立即处理以进行后续实验。其次，对一个肿瘤什么时候以及取几次样本？第三，这个肿瘤的哪个部位用来分析以及是否要分析它的转移位置的肿瘤信息。
理想情况下，应该使用核心方法例如对多病灶肿瘤以及单细胞DNA测序，单细胞RNA测序，多部位和单个细胞的表观遗传标记，单细胞候选标记蛋白CyTOF同时进行分析。肿瘤本身及其微环境包括肿瘤浸润淋巴细胞也应该同时分析。这些数据可以和其他实验数据来相互补充来衡量肿瘤空间异质性或游离DNA或循环肿瘤细胞的研究。这些分析将提供详细的蛋白质，基因组和转录组图谱，但要重建病人特定的调控网络，生物信息学的算法也将需要大幅改善。
研究人员通过分析和整合这些大量研究数据所提供的信息，将开发出新的通过不同的检测来预测肿瘤预后和疗效的方法，进而，使研究人员能够继续深入了解细胞异质性的重要性和影响。
结束语
从本次会议的一个带回来的信息是，肿瘤的异质性的现象可能会影响一段时间癌症研究的各个方面，包括肿瘤生物学如何被理解，研究肿瘤的技术如何发展和如何治疗患者。这次会议是独一无二的，其目标是确认问题，而不是答案，我们希望这小组专家描述的“已知的未知”能在广大社会的研究和协作上擦出火花。
原文：
Toward understanding and exploiting tumor heterogeneity
Ash A Alizadeh1–3, Victoria Aranda4, Alberto Bardelli5,6, Cedric Blanpain7, Christoph Bock8,9, Christine Borowski4, Carlos Caldas10, Andrea Califano11–13, Michael Doherty14, Markus Elsner15, Manel Esteller16, Rebecca Fitzgerald17, Jan O Korbel18, Peter Lichter19, Christopher E Mason20, Nicholas Navin21,22, Dana Pe’er11,23, Kornelia Polyak24, Charles W M Roberts25, Lillian Siu26, Alexandra Snyder27, Hannah Stower4, Charles Swanton28–30, Roel G W Verhaak22,31, Jean C Zenklusen32, Johannes Zuber33 & Jessica Zucman-Rossi34
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