目前10x Genomics推出的Visium空间转录组组，支持新鲜/冷冻切片，我们要想拿到高质量的空间转录组实验结果，样本制备也是至关重要的！今天小编将介绍一下Visium空间基因表达样本冰冻包埋的那些事儿！

新鲜组织选取和预处理

组织大小：空间转录组Visium芯片的捕获面积为6.5mm x 6.5mm，所以在选择样本前，首先确认好最佳的取材位置及合理组织大小，保证Vsium芯片的有效利用率。

组织预处理：新鲜组织样本取下后要迅速用预冷的PBS溶液或生理盐水进行冲洗，去除组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。（此步骤一定要吸干水分，如有液体残留，OCT包埋后，组织表面形成冰晶，影响切片效果）。整个样本处理过程需要保持低温环境。

组织冰冻步骤

1. 在金属烧杯中加入三分之二的异戊烷(使样本足以完全浸入液体中)， 然后放入液氮容器(与异戊烷的液面相平)中，使其充分接触，孵育15分钟。同时将所有过程中的采集器具进行预冷。

2. 用预冷的样本匙将新鲜组织浸没在异戊烷中，速冻约1min或直至组织完全冷冻。

3. 采用异戊烷而不是液氮的原因是液氮的沸点低，组织直接放入液氮后会沸腾，在组织周围产生气穴，导致组织降温过程中不同区域降温不同，改变组织内部形态甚至碎裂，影响组织形态。因此该步骤一定要用异戊烷进行冻存，如果没有异戊烷，可以跳过该步骤，直接将新鲜组织进行OCT包埋后速冻。

4. 一旦冷冻，将组织转移到一个预冷的WHEATON CryoELITE低温冷冻瓶中，并放置在干冰上。接下来冷冻组织可放置在-80℃下长期保存或立即进行下一步(冷冻组织包埋)。为了防止组织样本的蒸发和脱水，速冻组织样本必须储存在密封的容器中。

组织冰冻图

冰冻组织的包埋前准备

冰冻组织的包埋具体步骤

1.取一个适当大小的冷冻模具，在加入OCT和组织之前，对冷冻模具进行组织方向的标记。因为一旦冷冻， OCT很快就会变白，这使得以后很难确定组织的方向性。

2.将冷却后的OCT注入冷冻模具，且不要产生气泡。

3.从-80℃取出冷冻组织或者将新鲜组织样本放入置于干冰上且有锡纸包裹的托盘中。

4.使用预冷镊子，将冷冻的组织放入OCT，再用OCT覆盖暴露的组织表面。确认没有气泡，特别是在组织附近没有气泡。

5.立即将含有组织和OCT的冷冻模具放在干冰上。

6.等到OCT完全冻结，将OCT包埋的组织块储存在-80℃的密封容器中，长期保存或立即进行冷冻切片。可以使用WHEATON CryoELITE低温冷冻管或可重复密封袋来储存组织块。从冷冻模具中取组织块时，可以对组织块进行修剪，使其适合冷冻容器。

冰冻组织的包埋及OCT组织块的修整

OCT包埋的优点

在冰冻切片之前，冰冻的组织样本会包埋在OCT中。与石蜡或基于树脂的包埋技术不同，OCT不与影响抗原性的蛋白质和其他分子相互作用。OCT组织包埋有以下优点：

保护组织结构，并在冷冻切片时提供结构支持。

在切片过程中保持最佳温度，从而使切片光滑。

具有水溶性，可以兼容多种染色程序。

样本质检

当我们完成组织冰冻包埋以后，我们需要进行样本组织形态学检测和RNA 完整性检测。

组织形态学检测：冰冻切片，做普通H&E染色即可。主要观察组织形态上是否完整，比如是否有大的裂痕、冰晶形成而产生的气泡、褶皱等，在客户可以接受的范围之内。

RNA完整性检测：收集冰冻切片10~20片，提取 RNA，跑2100检测。RNARIN 值应大于7，即可进行空间转录组文库的构建。

任喜梅  | 文案