影响因子：10.3
研究概述：肺癌是呼吸系统中最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因。世界卫生组织根据组织学类型将恶性肺肿瘤分类为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌，其中前者约占85%，后者占15%。NSCLC主要包括腺癌和鳞状细胞癌。目前，肺腺癌（LUAD）是NSCLC中最常见的类型，约占肺癌病例的40%。程序性细胞死亡（PCD），也称为调节性细胞死亡，是一个关键的生理过程，它在维持组织稳态和清除受损或不必要的细胞中发挥着关键作用。PCD可以通过包括凋亡、自噬、免疫原性细胞死亡、铁死亡等等。在这些PCD机制中，有几种与线粒体功能障碍相关；线粒体在为细胞功能提供能量、调节细胞信号通路和控制PCD中发挥着关键作用。并且，最近的研究表明癌症主要是一个线粒体代谢疾病，线粒体功能障碍的特征在于结构、功能和动态变化，这些都与肿瘤发生有关。线粒体形态的破坏，如形状、大小或嵴组织的変化，可以损害正常的线粒体功能并触发PCD。在过去的几十年中，大量证据阐明了线粒体功能障碍和PCD机制在恶性肿瘤的发病机制和转移进展中的关键作用。肿瘤细胞必须绕过多种细胞死亡方式并减轻线粒体功能障碍，以维持增殖和侵袭。尽管取得了这些进展，但全面阐明LUAD中线粒体扰动和PCD途径之间复杂相互作用的研究仍然缺乏。为了填补这些知识空白，作者引入了一个与线粒体相关的PCD-signature（MPCDS），以预测LUAD中治疗干预的效果和预后。具体研究如下：
本文结合不少热点，包括18种细胞死亡，线粒体基因，百种机器学习等。
研究结果：
阐明线粒体和PCD相关生物标志物的作用
肿瘤细胞可以通过多种策略逃避PCD机制，影响肿瘤微环境，从而限制免疫反应，这已成为当前癌症治疗中的一个重要障碍。众多研究表明，线粒体功能与PCD之间存在密切联系。为了更好地阐明这种关系，作者筛选了一系列特定于LUAD的线粒体和PCD相关生物标志物。作者将GTEx的正常肺组织数据与TCGA的LUAD样本整合，进行差异表达分析，识别差异表达的MPRGs（图A）。接下来，作者进行了单变量Cox分析，以识别与预后相关的MPRGs（图B），最终鉴定出92个与预后相关的MPRGs（p<0.05）。进一步的GO和KEGG富集分析揭示，MPRGs主要富集在线粒体组分、自噬调节、凋亡、PI3K-Akt等信号通路中（图C-D）。MPRGs的染色体位置和表达情况如E所示。为确保数据集之间的可比性，作者去除了七个LUAD转录组队列的批次效应（图F）。CNV状态分析显示MPRGs中频繁发生的变化，其中STYXL1和STAT1表现出最广泛的CNV扩增（图G）。
开发和验证癌症患者预后及免疫治疗适用的MPCDS评分
作者使用92个与预后相关的MPRGs的表达谱，通过机器学习组合算法开发了一个MPCDS评分。TCGA数据集作为训练队列，六个GEO数据集用于验证。最终，Lasso+Stepcox（向前）算法成为最优模型（图A）。MPCDS评分在所有七个队列中区分患者预后（图B-H）。高MPCDS组的患者比低MPCDS组的患者预后更差。有趣的是，作者使用模型的公式外推了免疫治疗队列的MPCDS评分，并在三个LUAD免疫治疗队列（图I-L）和三个泛癌队列（图M-P）中发现了一致的结果。低MPCDS组似乎更适合免疫治疗，因为他们在治疗后显示出更好的预后（图I-P）。此外，使用TCIA网站计算的IPS也表明，低MPCDS组更适合接受PD-1、CTLA-4或其联合疗法的治疗（图Q-T）。
MPCDS在预后中具有优越的预测性能
作者为了评估MPCDS的预测效力，整合了七个数据集的临床特征。MPCDS显示出比其他任何临床特征（如年龄、性别、分期、EGFR状态等）更高的C指数值（图A）。随后，作者基于MPCDS模型基因在所有数据集中的表达水平进行了主成分分析（PCA）。结果显示，模型基因的表达水平可以有效地区分LUAD患者，高MPCDS组和低MPCDS组成为两个不同的簇（图B）。ROC曲线进一步证实了MPCDS评分可以可靠地预测LUAD患者的预后，并在所有数据集中得到验证（1年、3年和5年的AUC值通常高于0.65，图C）。接下来，作者将MPCDS与114个先前发表的LUAD签名进行比较，发现MPCDS在所有数据集中都展现出最佳的预测性能，有着最高的C指数值（图D）。
免疫浸润相关基因在高MPCDS和低MPCDS组中表达差异
作者接下来在基因组层面比较揭示了高MPCDS组和低MPCDS组之间免疫细胞比例的差异。低MPCDS组中的白细胞、淋巴细胞和NK细胞比例高于高MPCDS组（p<0.05）（图A-D）。此外，作者使用了肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）评分，结果发现TIL分数在低MPCDS组中更高（p<0.05）（图E）。IFNG水平也在低MPCDS组中更高（图F）。免疫调节基因在肿瘤免疫反应中扮演着重要角色，于是作者进一步比较了两组之间免疫调节基因的相对表达水平。低MPCDS组似乎更倾向于激活MHC II类分子和共刺激分子，而高MPCDS组则显示MHC I类分子和某些共抑制分子的激活（图G）。此外，作者使用ssGSEA算法计算了高MPCDS组和低MPCDS组之间免疫细胞浸润和免疫相关通路活动的丰度。结果与之前的发现一致：低MPCDS组有更高的免疫细胞丰度，如B细胞和辅助T细胞，以及II型干扰素反应和抗原呈递相关免疫通路的激活（图H）。TIMER2.0数据库计算的结果进一步证实了这些发现（图I）。为了确认上述结果，作者检查了TCGA数据库中高MPCDS组和低MPCDS组的H&E切片，发现低MPCDS组中有更多淋巴细胞浸润（图J）。
不同细胞类型中MPCDS分布和细胞相互作用的详细探索
作者利用单细胞RNA转录组数据（GSE189357和HRA001130）探索了MPCDS在不同细胞类型中的详细分布。首先作者在这些数据集中注释了主要的细胞类型（图A-D），并检查了MPCDS得分在不同细胞群中的分布和强度（图B-E）。基于中位数MPCDS得分，作者将细胞群分为高MPCDS组和低MPCDS组，以观察细胞类型的比例（图C,F）。结果发现，高MPCDS组中循环细胞的比例更高，而如B细胞、浆细胞和NK/T细胞等免疫细胞的比例较低。这一发现与bulk转录组分析结果一致。小提琴图也显示循环细胞类型具有最高的MPCDS得分（图G,H），表明更高的MPCDS得分可能与更大的增殖和干细胞潜能相关。此外，作者检查了高低MPCDS组之间的细胞相互作用（图I-K），发现高MPCDS组具有更强的细胞-细胞通讯和更强大的输出和接收信号（图L,M）。高MPCDS组还可能有更强的促肿瘤信号通路，包括VEGF、EGF和PDGF通路。
NME4作为潜在的致癌生物标志物
之前的分析验证了MPCDS分层有效地区分了患者预后和肿瘤免疫微环境的差异。为了识别与MPCDS相关的潜在生物标志物，作者关注了一个关键模型基因——NME4。目前，关于NME4在肿瘤进展中的作用的文献尚不充分。作者分析揭示了NME4与MPCDS之间存在显著的正相关（相关性=0.55, p<0.05，图A）。kmplotter网站一致的结果表明，NME4高表达的LUAD患者预后较差（图B）。HPA数据库证实，与正常肺组织相比，NME4在LUAD肿瘤样本中表达较高（图C-D）。作者进一步研究了NME4是否与MPCDS一样，能够区分免疫微环境。NME4与大多数趋化因子和受体、MHC分子以及免疫共刺激和共抑制分子的表达呈负相关，这表明NME4可能在调节肿瘤免疫中发挥作用（图E）。为了探索NME4在LUAD肿瘤发生中的功能作用，作者使用特定的siRNA在A549和H1299细胞中敲低了NME4表达。CCK8实验表明，随着NME4敲低，LUAD细胞的OD值下降，表明增殖能力降低（图F-G）。集落形成实验显示，NME4敲低的LUAD细胞的集落数量显著减少（图H）。Transwell实验证实，NME4敲低抑制了肿瘤细胞的侵袭和迁移（图I-J）。
NME4表达与免疫细胞浸润
作为MPCDS的标记物，作者对NME4的免疫相关特性进一步探索。随着NME4表达的增加，免疫细胞逐渐减少（例如，CD8 T细胞、B细胞等）。这一观察结果被多种算法反复验证（图A）。作者使用自己的石蜡切片对NME4和CD8进行染色，发现高NME4表达的患者CD8细胞浸润减少（图B）。基于CD8+ T细胞的空间分布，作者将切片分为炎症型、排除型和荒漠型，发现炎症型患者的预后最佳（图C）。炎症型的NME4表达最低，荒漠型最高，排除型介于两者之间（图D）。此外，通过将患者分为高NME4表达组和低NME4表达组，观察到高NME4表达的患者预后较差（图E）。为了进一步研究NME4与其他免疫细胞的分布关系，作者进行了多重免疫荧光染色，揭示了低NME4表达的患者有更多CD3+ T细胞和CD20+ B细胞的浸润（图F-G）。
NME4敲低增强CD8+ T细胞浸润并提高抗PD-1疗法的能力
为了评估NME4在体内的免疫调节效应，作者使用LLC小鼠肺腺癌细胞系在免疫完整的C57BL/6小鼠中构建了皮下异种移植瘤模型，随后对这些小鼠进行了PD-1单克隆抗体（mAb）或IgG同型对照的治疗（图A）。结果显示，与对照组相比，NME4敲低显著抑制了肿瘤生长，与PD-1 mAb治疗的结果一致。此外，NME4抑制与PD-1阻断的联合治疗在减少肿瘤负担方面导致了最显著的效果，且未观察到体重减轻或其他常见的毒性效应（图B-E）。流式细胞术分析表明，PD-1 mAb和NME4敲低均增强了CD8+ T细胞的浸润和激活。值得注意的是，PD-1 mAb和NME4敲低的联合治疗在肿瘤区域导致了活化CD8+ T细胞的最显著富集（图F-H）。这些发现表明，NME4敲低增强了CD8+ T细胞的浸润和功能，从而显著提高了抗PD-1疗法的效力。
研究总结：
本研究采取了干湿结合的模式，其中干实验的工作量不小。具体而言，本篇文章是一项全面且深入的研究，旨在通过分析线粒体PCD动态来提高LUAD患者的预后准确性和免疫疗法效果。作者通过对全球七个大型队列中的1231名LUAD患者的数据进行分析，利用机器学习技术，开发了一个基于线粒体相关PCD签名（MPCDS）的新模型。这一模型不仅在预后预测上超越了先前发表的114个LUAD签名，而且在多个免疫疗法队列中有效地预测了包括LUAD、黑色素瘤和肾透明细胞癌在内的患者治疗结果。研究的一个重要发现是，MPCDS与免疫特征显著相关，高MPCDS组的患者显示出减少的免疫活性和趋向于“冷肿瘤”的特性。作者发现NME4与LUAD患者的预后不良相关，尤其是在CD8沙漠表型中。通过多重免疫荧光技术，作者确认了NME4与免疫细胞的空间共定位和排斥关系。进一步的实验揭示了NME4在体外和体内调节LUAD细胞增殖和侵袭的能力，重要的是，抑制NME4增加了CD8+ T细胞的丰度和活性，并在体内增强了抗PD-1疗法的抗肿瘤免疫。这项工作不仅在生物信息学分析上表现出了巨大的工作量，而且在实验验证方面也投入了大量的努力。总体而言，这篇文章的研究工作量大，涉及多个复杂的分析步骤和实验验证，为肺腺癌的研究领域提供了贡献。
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