交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器

1前言

随着生命科学的发展进入分子水平，有人预言21世纪将是检验医学的世纪，即从分子水平对疾病进行诊断和治疗。这就要求临床生物化学检验准确、快速、简便、标本微量化、方法标准化、且经济实用。生物传感器正是在此要求下出现的一类跨领域、多学科的前沿诊断仪器。

国内外对生物传感器展开了广泛深入地研究，已经研制出了葡萄糖生物传感器、乳糖生物传感器、尿酸酶生物传感器、DNA生物传感器、BOD生物传感器、测酚生物传感器等多种类别的生物传感器，来满足人们在临床检验、环境监测和生化分析[1-3]等领域中的需求。

本实验将纳米二氧化硅凝胶和尿酸酶紧贴于蛋膜上，将酶膜紧贴于普鲁士蓝（PB）修饰的玻碳电极表面，然后以自制铂片电极为对电极、甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，制成尿酸酶生物传感器。当体液中的尿酸通过酶膜时，与酶进行反应，检测出该处产生的反应电流，然后将其换算成尿酸浓度加以显示。应用尿酸酶传感器测定人体血和尿中尿酸的浓度，是一种准确、快速、简便的方法，可帮助诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病。

2  尿酸酶生物传感器的工作原理

尿酸酶生物传感器的工作原理是：尿酸在尿酸酶作用下，被分子氧氧化成尿囊素，并产生二氧化碳和过氧化氢。根据反应前后氧的消耗，我们用电极监测溶液中氧的变化，就可推算出尿酸的浓度，其工作机理[4]如图2：

交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器

图1尿酸在尿酸酶作用下的反应机理

Figure1 Principle of uric acid under the uricase

3  实验部分

3.1 仪器与试剂

试剂：尿酸酶（4.6units/mg， Sigma公司），牛血清白蛋白（BR），戊二醛（CP），磷酸氢二钠，磷酸二氢钾（AR），氯化钠(AR)，鸡蛋，气透膜，实验用水为二次蒸馏水。

仪器：玻碳电极（天津兰力天仪器有限公司），铂电极（自制，铂片长×宽×厚为5×4×0.25mm），甘汞电极（上海雷磁），CHI600型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。

3.2 尿酸酶电极的制备

取新鲜鸡蛋壳小心剥离蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸馏水清洗；称取12.5mg牛血清白蛋白（BSA）溶于250μL 10g•L-1尿酸酶溶液中；将蛋膜铺于洁净的玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜；在膜上依次滴加25μL尿酸酶-牛血清白蛋白混合溶液、改性纳米二氧化硅凝胶液、5μL 2%戊二醛溶液，室温放置3~4h，置4℃冰箱冷藏过夜；过夜后的蛋膜用磷酸缓冲液(PBS)漂洗数次；将酶膜紧贴于PB修饰的玻碳电极表面，覆盖气透膜，即制成尿酸酶电极[5,6]。

实验流程如图2所示。

交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器

图2 纳米颗粒增强的尿酸酶电极制作示意图

Figure2 Manufacture flow chart of nanoparticles strengthen uricase electrode

3.3 实验方法

采用三电极体系进行检测：饱和甘汞电极为参比电极，制作的尿酸酶电极为工作电极，自制铂片电极为对电极，底液为0.1mol ·L-1的KCl 磷酸盐缓冲溶液，在一定的温度下进行检测。测量时，先将三电极置于缓冲溶液中，加一电压于工作电极(0.4ＶvsSCE)，当背景电流值减小至一恒定值时，将电极放至被测尿酸溶液中，分别记录不同时间的电流响应值，扣除初始背景电流值，即为被测尿酸离子浓度的电极电流响应值。

4  影响因素分析

4.1 尿酸浓度的影响

测量不同浓度尿酸的响应信号，使得电极响应与尿酸浓度成很好的线性关系，酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安如图3所示。确定尿酸酶生物传感器检测尿酸浓度的线性响应范围，如图4 所示。实验测定尿酸浓度的线性响应范围为7.5×10-6~1.5×10-4mol·L-1。

交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器

图3酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安图    图4尿酸浓度与响应电流线性关系图

Fig3 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor        Fig4 Linear relationship’ chart of difference of urate standard in different concentration of uric acid                  current response solutions on the urate biosensor

(a.112.5μg/mL, b.75μg/mL, c.37.5μg/mL, d.7.5μg/mL, e.0μg/mL)         

4.2 尿酸酶浓度的影响

向尿酸溶液中多次加入尿酸酶，以测定不同浓度尿酸酶对氧化峰电流的影响。电流响应随着尿酸酶浓度从零到某浓度的增加而增加。综合考虑电流响应和经济因素，选择最适宜的尿酸酶浓度1.5U。

4.3 纳米二氧化硅的影响

酶电极的性能是由酶的催化活性、酶活性中心和导电基质之间电子交换速率决定的。纳米颗粒比表面积大、表面自由能高，吸附能力较强，把纳米颗粒引人到传感器研究中，可以使更多的酶分子可以固定在纳米颗粒表面。另外，由于纳米颗粒尺寸很小，有可能与酶内部的FAD亲水基团发生作用，从而引起酶构型上的变化。这种变化使得酶的活性中心FAD更接近底物，提高了酶的催化效率。改性纳米SiO2颗粒对生物分子具有很好的选择吸附性，可望实现纳米颗粒与酶分子活性中心及电极之间的直接电化学作用，大大增强生物传感器的灵敏度。本实验对不添加纳米二氧化硅、添加纳米二氧化硅、添加改性的纳米二氧化硅，所制备的尿酸酶生物传感器进行了比较，实验证明纳米二氧化硅有增强电流响应信号的作用。

4.4 缓冲溶液pH值的影响 

缓冲溶液pH值对酶催化反应速率和酶的活性有较大影响，如图5所示。尿酸酶最适宜pH范围较宽。综合考虑酶的活性以及响应电流的最大的灵敏度，选择最适宜的pH值6.5。

交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器

图5 pH值对酶生物传感器响应信号的影响    图6 温度对酶生物传感器响应信号的影响

Fig5 Effect of pH on the current response      Fig6 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor

of the enzyne biosensor                    in different temperature

(a.25℃, b.20℃, c.30℃, d.35℃, e.10℃)

4.5 温度的影响

温度的变化将影响酶的活性及酶催化反应速率。在10~35℃范围内考察氧化峰电流与温度的关系，如上图图6所示。氧化峰电流随温度的升高而增大。考虑温度较高时酶易变性失活，选择最适宜的温度25℃。

4.6 工作电极的影响

将酶膜分别固定在铂电极、玻碳电极、石墨电极上，观察响应电流的灵敏度，选择最适宜的固定电极-玻碳电极进行实验。

5  结论

本方法研制的尿酸酶生物传感器具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、所需试样少的特点，通过进一步研究后，有望应用于临床，帮助诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病。