Molecular Therapy Nucleic Acids

Hi~大家好，今天小编要和大家分享的是在今年十月份发表在Molecular Therapy Nucleic Acids(IF:7.032)杂志上的一篇关于突变特征与免疫应答的文章。

黑色素瘤和非小细胞肺癌患者中类时钟突变特征与免疫检查点抑制结局的关联性

一．研究背景

免疫检查点抑制剂(ICI)已经在治疗黑色素瘤和NSCLC取得了显著的临床疗效，此外，肿瘤突变特征在整个肿瘤发生过程及异质性中相当于内源性和外源性因素的指纹。然而在ICI治疗的患者中，肿瘤突变特征与免疫应答之间的关系仍然不清楚。因此，今天和大家分享的文章就在黑色素瘤及非小细胞肺癌患者中对这种关系进行了分析。

二．数据及方法

1.基因组数据和临床信息：作者从先前的免疫治疗研究中得到全外显子测序平台的体细胞突变谱，其中包括216例黑色素瘤样本及113例NSCLC样本的两个队列。作者重注释得到了队列的体细胞突变数据。此外，作者从先前研究及TCGA数据库中得到了两个队列的表达信息。同时作者也从先前研究中收集了靶向下一代测序的基因组谱及免疫治疗的临床数据。所提取的用于测序的DNA和RNA均来自于治疗前和原发肿瘤组织。

2.识别癌症驱动基因：作者使用OncodriveCLUST算法探索了癌症驱动基因，并使用MutSigCV算法对基因集进行过滤及验证。最终得到的候选基因满足以下条件：在OncodriveCLUST、MutSigCV两个方法中具有统计学显著性，且在人类癌症细胞系百科全书（CCLE）中表达。

3.破译在基因组中起作用突变信号：作者使用Maftools包在两个队列的WES基因组数据中提取突变特征，Maftools中的ExtractSignatures函数能将突变矩阵因式分解为两个非负矩阵 ‘signatures’及‘contributions’矩阵，其中‘signatures’代表突变过程，‘contributions’代表相应的突变贡献度，该框架基于贝叶斯变异非负矩阵分解，能够自动确定最优的突变特征提取数量。SigMA是一个特征分析工具，其能根据已知的肿瘤特异性特征组成，优化从混合捕获面板检测特异性突变特征。突变特征通过计算癌症体细胞突变目录(COSMIC)中30个已验证的突变特征的余弦相似度来注释。

4.GSEA及网络分析：作者使用limma和fgsea R包评估具有不同时钟样特征亚群的样本的功能通路水平变化，对表达数据进行标准化后，进行差异分析，然后使用logFC进行GSEA分析。

5.CIBERSORT评估：作者通过估计相对亚群的RNA转录识别细胞类型（CIBERSORT）对每个样本中免疫细胞亚群的丰度进行估计。

6.量化肿瘤免疫功能失调和排斥(TIDE)及T细胞炎症基因表达(RNA)谱(GEP)：TIDE算法利用一组基因表达markers来估计两种不同的肿瘤免疫逃避机制，包括肿瘤浸润毒性T淋巴细胞(CTL)的功能失调和免疫抑制因子对CTL的排斥。TIDE预测分数越高的患者，肿瘤免疫逃逸的可能性越大，因此患者的免疫治疗应答越差。T细胞炎症基因表达(RNA)谱(GEP)被用来预测PD-1阻断的临床应答。

7.利用ssGSEA进行免疫细胞浸润评估：作者使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）量化肿瘤微环境中过度呈现的28个免疫细胞亚群的浸润水平。从最近研究检索每一种免疫细胞类型的特征基因面板。以R包GSVA中的富集评分来表示每种免疫细胞类型的相对丰度。每个免疫细胞类型的ssGSEA评分标准化为0 ~ 1。采用多维尺度(MDS)和高斯拟合模型估计免疫细胞过滤的生物相似性。

三．研究的主要内容及结果

1.突变特征在免疫治疗黑色素瘤中的作用

在文章研究的第一部分作者分析了突变特征在免疫治疗黑色素瘤中的作用，文章分析流程如图1所示，作者从216个先前全外显子测序的数据集中获得体细胞突变谱并对其进行标准化。为了进一步探索黑色素瘤患者中的突变过程，作者从体细胞突变数据刻画了突变特征。作者提取了带有各种突变贡献度的三个突变特征，用余弦相似度对COSMIC命名特征重注释（图2A）。图2B展示了每个样本中提取的突变特征的比例和贡献度，可以观察到特征1(类时钟突变特征)主要是C>T，其在大多数癌症类型中与年龄相关的5-甲基胞嘧啶自发脱氨的积累有关，除此之外，作者也对特征7（紫外线特征）及特征11进行了分析。接下来，作者为了研究这些提取的突变特征是否与免疫应答抵抗有关，将提取的突变特征分层到二元变量模型中进行进一步分析。结果在这三个特征中，可以观察到具有时钟样特征的患者与黑色素瘤队列中较差的生存结果显著相关（图2C），在控制了年龄、性别、单克隆抗体类型和临床分期后，这种相关性仍然具有统计学意义（图2D）。进一步研究也发现具有时钟特征的样本更有可能聚集在免疫抗性结果的亚群中。研究也发现六种单核苷酸变异(SNVs)在类时钟和非类时钟特征分组中的分布也有显著差异，平均来看类时钟特征亚群在双嘧啶上呈现较少比例的C-to-T转换（图2E,F）。此外，作者对时钟样特征TML进行比较，发现有时钟样特征的患者TML显著降低（图2G）。

图1 研究流程 图2 在ICI治疗的黑色素瘤队列中类时钟特征与免疫无应答有关

2.识别与类时钟特征相关的驱动基因

在文章的第二部分，作者结合OncodriveCLUST算法及MutSigCV算法对与类时钟特征相关的驱动基因进行了分析，如图3A所示这两个方法在黑色素瘤队列中识别出了BRAF, NRAS, HRAS及 PPP6C四个潜在的驱动基因。图3B则展示了这些潜在的驱动基因的突变蓝图。作者进一步分析了驱动基因突变率与时钟样特征之间的关系，发现BRAF和PPP6C的改变更有可能聚集在非时钟样特征亚群中（图3C）。

图3 黑素瘤驱动基因突变与类时钟特征状态有关

3.NSCLC免疫治疗队列的类时钟特征

在这一部分，作者在NSCLC队列中对类时钟特征进行了分析，与黑色素瘤队列分析相似，作者从肺癌中提取具有不同突变活性的突变特征（图4A，B），并用COSMIC注释。NSCLC队列中提取的特征包括特征1（类时钟特征），特征4及特征7，分析也发现具有类时钟特征的患者在矫正年龄性别等因素后也与更差的预后有关（图4C，D）。此外，作者将时钟样特征与TML进行分析，发现有时钟样特征的患者TML显著降低（图4E）。在联合癌基因检测算法的免疫治疗数据集中，KRAS被确定为一个潜在的肺癌驱动基因（图4F），接着作者进一步计算及推断发现具有KRAS突变的样本聚集在非时钟样特征亚群中（图4G）。

图4在免疫治疗的NSCLC队列中类时钟特征与免疫无应答有关

4.靶向序列队列中进一步证实类时钟特征

目前，大多数精准肿瘤平台使用下一代靶向基因面板测序来检测带有免疫应答的基因组突变，为了进一步研究靶向NGS-panel数据集中的突变过程，作者使用基于NNLS算法的SigMA分析工具分解了接受ICI治疗的黑色素瘤和NSCLC样本的突变特征，这些样本的肿瘤都进行了MSK-IMPACT 面板测序。接着作者将样本按照类时钟突变贡献，将患者分为类时钟亚群及非类时钟亚群，并进行生存分析。研究发现在两个队列中具有类时钟特征的患者预后更差（图5A,B），并且在校正其他临床因素后结果仍然显著（图5C，D）。由于TML在预测ICI治疗的免疫应答方面起到重要作用，因此，作者比较了类时钟亚群及非类时钟亚群的突变负荷，结果发现具有类时钟特征的样本的TML更低（图5E，F）。

图5 从靶向NGS面板测序数据集中提取的类似时钟的突变特征也与免疫无应答相关

5.与时钟特征相关的免疫相关通路和免疫细胞浸润

在文章的最后一部分，作者进一步研究了类时钟突变特征背后的潜在机制，对黑素瘤基因表达谱的基因集富集分析(GSEA)显示，在不同时钟样特征亚群中，涉及干扰素-γ、PD-1信号转导、免疫细胞因子和NF-Kappa B通路显著改变（图6A）。为了确定时钟样突变特征与免疫细胞浸润的关系，作者用ssGSEA方法制作了一个热图来可视化28个浸润的免疫细胞群体的相对丰度（图6B），结果发现抗肿瘤白细胞亚群，包括效应记忆CD4+、CD8+ T细胞和自然杀伤T细胞在具有时钟样突变足迹的样本中显著减少。此外，作者利用基因表达谱数据(使用CIBERSORT算法)评估了LUAD肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞的丰度结果发现CD8+ T细胞、CD4+记忆活化T细胞和巨噬细胞M1在突变时钟样特征亚群中富集较少，而CD4+记忆静止T细胞、单核细胞、树突状细胞在该亚群中富集较多（图6C）。此外，TIDE在时钟样亚型中的肿瘤免疫逃避预测得分显著高于非时钟样亚型（图6D）。T细胞炎症基因表达谱(GEP)算法也显示了在时钟样特征亚群中较低的炎症分数（图6E）。这些结果表明，在黑素瘤和非小细胞肺癌中，时钟样突变特征与免疫浸润的排斥显著相关。

图6 具有时钟样特征的显著富集通路和免疫浸润改变

到这里，这篇文章的主要内容就介绍完啦，文章将突变特征和免疫应答结合在一起进行分析，通过对黑色素瘤及非小细胞肺癌队列的研究，分析了类时钟突变特征与免疫检查点抑制剂的关联，这种从多个角度分析的方法我们可以借鉴学习。

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