第六章 利用生物发光共振能量转移监测GPCR-蛋白复合物
6.1 前言
在G蛋白偶联受体(GPCRs)的激活生命周期中，多种蛋白复合物的形成对该受体超家族介导的功能广泛性至关重要。GPCRs，从内质网(ER)出生一直到降解死亡的过程中，都与各种蛋白质形成复合物。已有报道证明，一些GPCRs从内质网到细胞表面的成熟和导航过程需要单跨膜域伴侣蛋白。
此外，这些蛋白可能会影响GPCR效应蛋白的功能。降钙素受体(calcitonin receptor-like-receptor)之所以能表现出不同的功能活性，就是因为它与ER上的三种不同的受体活性修饰蛋白(RAMP1, RAMP2/3)亚型相互作用，从而表现出不同的配体响应表型。另一个最近发现的单跨膜蛋白，黑素皮质素受体附属蛋白，已被证明对黑素皮质素受体2 (MC2R)正确的膜定位和信号传递能力十分重要。此外，该蛋白的突变还表现出对MC2R功能的影响。配体如激动剂和反向激动剂的结合，分别对增加或减少基础受体的活动水平至关重要。GPCR激活后，通常通过与一系列激酶的相互作用，即G蛋白偶联受体激酶(GRKs)作用的失活/脱敏阶段即迅速发生。这些蛋白质能够磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基羧基尾或另一个胞内循环，大大增加一类多功能接头蛋白β-arrestin的亲和力。
目前GPCR与β-arrestins相互作用的越来越多，与之广泛的功能密切相关。β-arrestin 1或2和GPCRs之间的相互作用主要是涉及脱敏和激活GPCRs内化。这些过程负责终止初始的GPCR - G蛋白相互作用，从而减弱G蛋白介导的信号通路，将活化的GPCR复合物运送到细胞内的各个隔间，并将受体再循环回到细胞表面。GPCRs在这些阶段的活动特点可以由两个不同的GPCR-β-arrestin以及进一步证明的GPCR-β-arrestin的结合动力学参数描述。这些特征描述了内化GPCR复合物的定位、降解和信号通路。扩展监测动态GPCR-β-arrestin相互作用提供了丰富的信息，可以洞察到细胞内GPCRs活动以及细胞对外界刺激的生理响应的变化。
以往人们认为GPCR介导的细胞信号传递是通过G蛋白的激活发生的。β-arrestins的多功能角色一直贯穿与独立于G蛋白质的表β-arrestin-介导的信号途径。最近发现，GPCR介导的信号传导与GPCR-β-arrestin复合物与涵盖下游信号分子的脚手架激酶的结合密切相关。这些信号活动是第二位的，但不一定从最初的G蛋白信号事件中分离出来，后者包括激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族，进而参与转录调控和细胞周期。
GPCRs的共价修饰，包括磷酸化、棕榈酰化和泛素化呈现动态作用模式，在细胞内分拣、膜定位和GPCR功能的一般调节中发挥关键作用。GPCRs和β-arrestins以及泛素的动态相互作用为我们提供了对调控GPCR内化，降解和信号处理更为深刻的理解。事实上,通过β-arrestin与两个已有深入研究的受体，β2-肾上腺素受体和 V2血管加压素受体的野生型和突变体嵌合形式的研究，很明显，泛素化对GPCR复合物的溶酶体或蛋白酶体降解是必不可少的。此外，动态β-arrestin泛素化直接调节信号激酶MAPKs(如ERK1和2)的脚手架等，从而决定两类β-arrestin结合GPCRs的不依赖于G蛋白的信号水平。
本文概述了GPCRs和相关蛋白之间的重要相互作用，阐明了描述时空相互作用的必要性，而后者不可避免地导致细胞生理学的变化。最近动态GPCR-蛋白相互作用的研究蓬勃发展，一方面得益于人类基因组计划成功地发现了更多的GPCR及其结合蛋白，另一方面得益于更多高效的相互作用功能研究手段。
6.1.1 GPCR-蛋白相互作用及生物发光共振能量转移电位(BRET)的测定
为了定义一个特定GPCR的新的效应功能，并描述GPCRs及其相互作用蛋白之间的关键分子关联的活性，生化和生物物理技术形成了主流使用的方法。这些方法中最新也最令人兴奋的是生物物理原理共振能量转移(RET)的应用。以此为核心的荧光共振能量转移(FRET)和它的姊妹生物荧光共振能量转移(BRET) 技术得到了广泛应用。其中，BRET技术为研究人员提供了更多的好处，这将在本章中详细描述。
自1999年首次用于研究生物钟蛋白之间的相互作用以来，BRET技术已经通过改进发光体、荧光体和底物成分而得到发展。
BRET方法中最近的两项进展包括对GPCR-蛋白相互作用的延长时间监测和利用突变荧光素酶提高检测的灵敏度，这些进展使得研究人员能够监测长期或难以捉摸的GPCR-蛋白相互作用。此外，BRET技术从小的单板样本量到多板GPCR -蛋白相互作用的高通量分析的能力证明了该技术的高度通用性。通过这种方式，BRET技术可以由小型实验室和商业实体实施，以帮助发现和开发治疗性GPCR靶向药物。BRET技术的应用将为许多研究人员提供必要的工具，以研究在GPCRs三个主要家族内、外之间GPCR -蛋白复合物的形成。
6.1.2生化和共振能量转移技术的优势和制约因素
传统的生物化学方法检测蛋白-蛋白相互作用，如GST pull down，免疫共沉淀和酵母双杂交试验，对体外形成某些GPCR -蛋白复合物提供了许多推断信息；然而，由于的高度准备和处理，这些信息的生理相关性常常受到质疑。因为细胞提取物的分离和膜蛋白的纯化涉及使用各种去垢剂的化学过程。由于GPCRs的高疏水性，这些过程可能使GPCR -蛋白复合物变性，导致复合物的人为聚集或分离。然而，使用严格的控制基础，例如使用一系列不同的加工去垢剂，可以进一步验证检测蛋白质相互作用的生化手段。在最佳条件下，这些生化技术确实能够直接推断出GPCR和另一种蛋白质之间的相互作用。另一方面，RET技术在整个实验过程中只能根据它们各自的邻近性变化来间接推断这种相互作用。然而，BRET所依赖的条件(即两个分子之间的距离)对于提出合理的相互作用是非常有利的，因为适当地标记为发光或荧光的分子发生BRET时，这个距离几乎等同于两个蛋白质之间的分子间相互作用。尽管如此，对有关构成蛋白相互作用的BRET数据的解释仍存在争议。这些解释包括改变细胞中相对或绝对的蛋白质浓度，以进一步验证真实的GPCR -蛋白质相互作用，6.2.2.7节中将进一步详细讨论。
使用BRET可能不会威胁生化分析作为确定GPCR -蛋白相互作用的主要手段，因为这些技术可以联合使用来加强相互作用的验证。生化研究可以识别和提供关于某种GPCR -蛋白复合物的存在和大小的证据，这些信息的获取依赖于所用抗体的特异性。然后利用BRET进行生物物理分析，通过使用一系列动力学模型和适当的对照进行二次验证，可以确定这种相互作用的近生理特异性。这为描述GPCR -蛋白相互作用的性质提供了一种更具结论性的方法，并可扩展用于监测相互作用的时间动态。
使用生化技术来定义GPCR -蛋白相互作用的相对时间特性是可能的，但是在多个时间点进行的测量需要更多的串行处理时间和资源。BRET技术通过消除分析后细胞处理水平克服了这些问题，从而增加了分析数据的生理相关性。此外，BRET提供了获取GPCR -蛋白复合物形成动态数据的能力，因为它们发生在37°的活细胞37C，并且是实时的。
6.2方法与途径
6.2.1 BRET原则
生物发光已经进化为一种原始的交流形式，用来从一个有机体到另一个的行为发出信号反应。刺胞动物的海洋生物，如水母和三色堇，通常表现出这种生物物理过程。这是当代BRET技术的基础，目前许多实验室使用BRET技术来研究细胞生物学中蛋白质-蛋白质的相互作用。BRET允许对假定的GPCR -蛋白复合物进行定性和定量监测。这一过程是通过供体酶(如Renilla luciferase, Rluc)对腔肠嗪底物的氧化而发生的。如果离荧光团受体(如增强型绿色荧光蛋白EGFP)足够近，该反应释放的能量以非辐射的偶极-偶极方式在荧光团能量激发谱对应的波长上进行传输。因此，根据其独特的发射光谱，荧光团将发射波长更长的光能。使用双滤光光度计可以监测和比较这两种过程发出的光能，以确定供体和受体之间是否发生了能量转移。这样，从受体荧光团释放出的能量水平比同时从腔肠素的氧化释放出的能量水平更高，这表明了物种之间的趋近性偏好RET。RET发生的物理距离(< 10nm)是显著的，因为在这个范围内的距离指示了生理的蛋白质-蛋白质相互作用。下图说明了BRET是如何发生的，以及如何使用它来评估GPCR和感兴趣的相互作用蛋白之间的相互作用。
BRET
Ward和Cormier最初描述了使用BRET检测蛋白质-蛋白质相互作用的原理。然而，首次利用BRET应用于蛋白质-蛋白质相互作用的发现是最近才发现的，并为涉及细菌、植物和哺乳动物细胞中蛋白质物种相互作用的研究奠定了基础。
荧光与中间分子能态的关系这一重要理论，阐明了偶极子-偶极子诱导的供体和受体的RET率和效率。供体和受体的光谱性质、两个偶极子的取向、量子产量和供体的生命周期都是至关重要的决定因素。福斯特的距离,也就是供体和受体之间能量转移的临界距离，等于供体的衰变率，是供体-受体对特有的，决定了RET的效率。重叠积分，或供体发射光谱和受体吸收光谱之间的光谱重叠，对于信噪比非常重要，这同样依赖于RET paie的光谱特性。尤为关键的是，RET的效率取决于供体和受体距离的6次方。通过监测β-arrestin构象中羧基和氨基末端之间的分子内距离判断其灭活和激活状态，是BRET精致的距离依赖的例子。
6.2.2使用BRET测定GPCR -蛋白相互作用
6.2.2.1评估BRET与FRET检测GPCR -蛋白相互作用的适用性
BRET是一种灵敏的技术，能够检测到GPCR-蛋白相互作用，这些相互作用要么是组成型的，要么是添加了激动剂等物质后产生的。FRET涉及到与BRET相同的物理原理；然而，许多差异导致了它们对特定用途的应用。FRET不需要荧光蛋白与目标蛋白的基因融合，只要有合适的抗体或存在表位，就可以检测到内源性蛋白之间的相互作用。虽然在BRET实验中，其中一种蛋白可以用荧光探针进行免疫标记，但另一种“伴侣”蛋白则需要与荧光素酶进行基因融合。自体荧光，或内源性细胞物质在外部光源刺激下的荧光，导致更高的背景噪声和更低的信号分辨率。当使用FRET时，这是一个大问题。FRET技术的衍生品，如时间分辨FRET (TR-FRET)和FRET荧光寿命成像显微镜(FRET- FLIM)，试图通过允许背景荧光衰减来消除背景自身荧光，提高信噪比。在TR-FRET的情况下，荧光半衰期较大的供体和受体物种被用来测量期望的蛋白质相互作用。另外，FRET-FLIM可以通过荧光寿命的变化监测能量转移；然而，这些数据可能会需要复杂的解释。由于不需要外部光源，BRET优于FRET，消除了荧光团光漂白。研究发现，这对于检测对光敏感的蛋白质(如生物钟蛋白)之间的相互作用特别有益。事实上，这一要求的必要性似乎是BRET技术的基础。此外，BRET在较长时间(数小时)内监控GPCRs和假定蛋白质之间的相互作用无细胞系统的干扰，无信噪比下降，尤其有利于内化和追踪通路的表征GPCRs。
在整个测量期间，除了维持和控制分析温度之外，还应该通过使用电子控制的注射器添加试剂(如底物和配体)，以更自动化的方式测量BRET。控制这些变量可能会导致更低的分析内和分析间的可变性和较少的归因误差。这对高通量BRET实验十分有益。
由于用于启动BRET的底物在整个细胞环境中扩散，在这个阶段无法确定GPCR-蛋白相互作用的区划。然而，利用最新进展，通过使用高分辨率过冷电荷耦合器件相机在细胞成像、突变Rluc酶来调整发射光的波长和量子产率与一系列的修改后的荧光受体蛋白，观察GPCR-蛋白在单个细胞的相互作用已经成为可能。
然而，FRET仍然是评估GPCR -蛋白相互作用细胞间隔的主要RET方法。由于可以应用近红外波长，动物活体成像通常采用FRET技术。Rluc短波长(<600 nm)底物发射的组织衰减阻碍了BRET在这些检测中的应用。然而，最近的一项研究发明了一种新的Rluc突变，这种突变会导致腔肠底物酶促氧化后发出的光的波长发生偏移，从而导致可用于测量的组织穿透光的数量增加。这为通过活体动物成像监测蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种可能的替代方法。
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