Smart-seq2(一)

Smart-seq： Smart-seq2的前身是Smart-seq，它是首个用于单细胞转录组测序的方法。Smart-seq的提出可以追溯到2012年，它的原理是通过在反转录过程中引入一个定制引物，将细胞内的RNA转录本进行全长合成。这使得可以获得单细胞水平上更详细和全面的基因表达数据。

Smart-seq2的改进： 随着技术的发展，Smart-seq2在Smart-seq的基础上进行了改进，以提高单细胞RNA测序的效率和覆盖度。Smart-seq2的引物设计更加精确，可以更好地应对低质量RNA样本，并且在捕获基因表达信息时表现更为灵敏。

技术特点：

1.全长转录本测序： Smart-seq2使用全长转录本测序的方法，使得可以获取细胞中每个基因的完整转录本信息，而不是只关注特定区域。这有助于更准确地了解单细胞的基因表达谱。

2.高灵敏度： 引物设计的改进和全长转录本测序的特点使得Smart-seq2在捕获低表达基因和检测单个细胞中稀有转录本方面更为灵敏。

3.适用性广泛： Smart-seq2的技术特点使其适用于各种细胞类型和样本来源，包括低质量的单细胞RNA。

4.单细胞分辨率： Smart-seq2具有较高的单细胞分辨率，可以在单细胞水平上深入挖掘细胞异质性和亚型。

5.低输入RNA样本： 与一些其他单细胞RNA测序方法相比，Smart-seq2对RNA输入量的要求较低，这使得可以应用于限制性的细胞样本。

分析流程：

和10x Gemonics不同，Smart-seq2在建库过程中，对每个孔中添加的index序列是已知的，所以整体分析思路是首先根据每个孔板中的index拆分fastq，然后进行比较、定量、基因表达技术。流程基本和bulk RNA-seq分析流程相似。最后将每个孔板中基因表达水平合并为所有细胞的表达。主要包括以下步骤：

1.质控

使用fastqc软件对原始测序数据进行质控，fastqc的使用见教程，（待补充）

2.拆分

sabre是一款根据barcode(index)进行拆分的软件，在github上下载之后（如果无法下载，请右侧扫码联系博主），执行下述命令

$ cd /path/to/sabre
$ make

执行完成之后，用ls查看当前目录，新生成的sabre即可使用

$ ls -l .
$ ll
total 67
-rw-r--r-- 1 *** group  1023 Feb  3  2021 LICENSE
-rw-r--r-- 1 *** group   924 Feb  3  2021 Makefile
-rw-r--r-- 1 *** group  4160 Feb  3  2021 README.md
-rw-r--r-- 1 *** group  1312 Feb  3  2021 barcode.o
-rw-r--r-- 1 *** group 16392 Feb  3  2021 demulti_paired.o
-rw-r--r-- 1 *** group 12104 Feb  3  2021 demulti_single.o
-rwxr-xr-x 1 *** group 27183 Feb  3  2021 sabre             #可执行文件
-rw-r--r-- 1 *** group  3424 Feb  3  2021 sabre.o
drwxr-xr-x 2 *** group  4096 Feb  3  2021 src

sabre可用于拆分单端和双端测序数据，具体用法如下：

$ sabre 

Usage: sabre <command> [options]

Command:
pe  paired-end barcode de-multiplexing
se  single-end barcode de-multiplexing

--help, display this help and exit
--version, output version information and exit

我们这里都双端测序结果进行拆分，使用方法如下：

$ sabre pe \
           -r R1.fq.gz \                #R1
           -f R2.fq.gz \                #R2
           -b barcode.txt \             #barcode: barcode_seq   file1_out   file2_out
           -m 2 \
           -u unknown_sepID.fastq \
           -w unknown_UMI.fastq